一是利用小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细 胞或愈伤组织细胞，从而建立单倍体的基因转化受体系统；
二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如 花粉导人法、花粉粒浸泡法和子房微注射法等。
特点
A、利用单倍体遗传转化受体系统进行基因转化，避免了基因显隐性 的影响，有利于基因的充分表达，通过染色体加倍后即可使基因 纯合，缩短了目的基因纯合的时间，加快了转基因育种过程； B、花粉管通道法和子房注射法由于操作简单，受实验室条件限制较 小，已成为目前国内常用的转基因方法之一，同时，花粉管通道 法是利用植物自身的有性生殖过程，有利于将现代的分子育种与 常规育种紧密结合，也有利于目的基因在转基因后代中的稳定表 达； C、受体取材受到季节的影响大。利用花粉管通道法等进行遗传转化 只能在短暂的开花期内进行，这是限制该系统应用的主要原因之 一。
2、方法和步骤
（1）DNA微弹的制备 60~100mg金粉 1ml无水乙醇中， 超声波洗涤 离心去乙醇 1ml无菌水洗 涤2次后，加 1ml无菌水重悬 25l悬浮 液 +25l DNA（1 g/ l），混均，再加 入25l 2.5mol/L CaCl2，手指振荡5次， 加入20 l 40% PEG4000，手指振荡5次， 混合液在室温下静置10min 离心5min， 移去50-60 l 上清，其余混均，每次用 量8 l
（2）材料的准备，将材料接入培养皿中， 把培养皿放入基因枪的样品室中， 并对准子弹发射中轴。 （3）按基因枪操作程序进行微弹轰击 （4）轰击后材料的培养和鉴定
3、影响基因枪转化效率的因素
（1）金属微粒的种类和直径 （2）沉淀助溶剂 （3） DNA纯度和浓度 （4）轰击参数：粒子速度、入射速度、 阻挡板至样品室高度、轰击次数等 （5）植物受体系统
培养条件是影响高频再生系统的重要因素 影响组培的效果 影响变异频率
温度 光照：强度、光周期和光质Biblioteka 高频再生系统的评价


中间繁殖体诱导率 中间繁殖体增殖率 植株分化率 变异率 移栽成活率
③抗生素敏感性试验
选择对抗生素敏感的受体材料是建立高效稳定转基 因受体系统的保证（农杆菌介导法） 外植体 诱导培养基 含不同浓度抗生素培养基 植株再生 综合评价
化的细胞存活下来，而杀死未转化的细胞。
选择标记基因通常与目的基因置于同一质粒
载体。亦可将二者分置于不同质粒载体进行共转 化，如此便于在后代筛选出无标记基因的转化植 株。
报告基因
通常目的基因所编码的产物不易检测，在转化初期无法 判断该基因是否已导入植物。为此，可将一个易于检测产物的 基因与目的基因相连，共同转化植物，借助该基因的表达检测
三、植物遗传转化的方法
（1）载体转化系统：农杆菌介导法、植 物病毒载体法； （2）直接转化系统：化学法（PEG法和 脂质体法）和物理法（基因枪法、电击 法和显微注射法等）； （3）种质转化系统：花粉管通道法、萌 动种胚浸泡法、子房和胚囊注射法等。
(一）农杆菌介导转化法
1、根癌农杆菌介导转化原理 农杆菌能浸染植物细胞并将其中所带 有的质粒中一部分T-DNA导入植物细胞 中，并整合到植物核 DNA上，然后在植 物细胞中得到转录和翻译，表达出目的 基因的性状。
基因 来源 细菌
基因产物 β—葡萄糖苷 酸酶 荧光素酶
检测方法 荧光分析法及 组织化学分析 法 光分析法
选择性试剂
告
萤火 虫 水母
基
gfp
绿色荧光蛋白 基因 胭脂碱合成酶 基因 章鱼碱合成酶 基因 Glufosinate 抗 性基因 潮霉素磷酸转 移酶基因 新霉素磷酸转 移酶基因 草甘膦抗性 基因
叶盘转化法
打孔器从消毒叶片上获得叶盘 在工程菌液中浸数秒
培养基上共培养2~3天
在含有抑菌剂的培养基上培养 转化体选择和再生
不同作物适宜的接种时间和接种菌液浓度*
外植体种类
小麦未成熟胚和 胚性愈伤组织 水稻胚性愈伤组 织 玉米未成熟胚 棉花下胚轴 大豆子叶
接种时间 /min
接种菌液浓度 /OD
60 15 10 1～3 10～30
题——筛选 ( screening ).
同时，即使在非常严格的筛选条件下再生的 转化体也仍可能存在假转化体 ( 或交叉保护的逃 脱体escapee), 所以必须对转化体（transformants
）进行严格的鉴定，以确证其为转基因植株（
transgenic plant）
1、 转化体的筛选
利用选择标记基因，借助一定的手段使已转
4、遗传转化受体系统的建立
（1）高频再生系统的建立 ①理想的高频再生系统应具备的条件
具有高的中间繁殖体的诱导率
具有高的植株再生能力 易培养，重复性好 体细胞无性系变异少
②高频再生系统建立的方法
高频再生系统的建立是建立高效稳定转基因受体系统的 基础
●外植体的选择
外植体的生理年龄
外植体的生理状态
外植体的遗传背景 选择的适宜外植体是建立高频再生系统的前提
内
容
一、 植物遗传转化系统概述 二、植物遗传转化受体系统的建立 三、 植物基因转化的方法 四、转基因植株的再生及其检测
一、 植物遗传转化系统概述
(general situation of plant genetic transformation system)
1、植物遗传转化（plant genetic transformation）是指利用重组 DNA技术，将外源基因导入植物 细胞，外源基因与受体植物染色 体整合并稳定遗传和表达的过程 或技术。 植物遗传转化技术是分子育种 的核心技术之一，已经成为培育 植物新品种的有效方法之一.
（3）原生质体受体系统
●以原生质体为受体材料，然后通过原生质体培 养获得再生植株的受体系统。
●特点： ■转化率高 ■获得再生植株无性系变异多，转化的外源基因 稳定性差 ■出现的嵌合体少 ■技术难度大
（4）生殖细胞受体系统
以生殖细胞如花粉和卵细胞为受体进行基因转化的系统 称之为生殖细胞受体系统，也叫种质系统。利用生殖细胞进 行基因转化有两种途径：
●培养基
培养基的筛选是高频再生系统的核心
培养基影响组培效果 培养基影响变异程度 培养基影响分化途径
●培养基
◆基本培养基 ◆激素的选择： 生长素（2，4-D、NAA、 IAA、IBA和2，4，5-T）和 细胞分裂素（ ZT、BAP、6-BA、2iP和 KT） ◆糖的种类和浓度 ◆有机附加物的选择
●培养条件
0.5～1.0 1.0～1.5 1.0 0.3～0.6 0.3～0.6
共培养时间 （ d） 2～3 2 2～3 2 2
原生质体共培养转化法
原生质体分离 原生质体培养 共培养2~3天（工程菌：原生质体=1：1000） 去菌培养和转化体的选择 植株再生
3、影响农杆菌介导法转化效率的因素
（1）农杆菌 （2）质粒 （3）受体材料 （4）共培养：时间、培养基和培养条件 （5）抗氧化剂
10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 1996 1997 1998 1999 2000 2001
年份
面积(万公顷)
2002
2003
2004
2005
全球转基因作物种植面积
1、怎样开展遗传转化工作
确定育种目标 获得目的基因 工程载体的构建 受体材料的选择 遗传转化受体系统的建立
基因枪转化法的特点
不受基因型限制，并且可用各种组 织或细胞作为靶材料
操作简便 外源基因随机整合，并且常常是多 拷贝整合，因而易造成转基因沉默 和转基因后代目的基因分离复杂化 与农杆菌转化法相比，其转化效率 还较低
四、转基因植株的再生及其检测
由于转化事件总是发生在少数细胞内，这就 带来了如何富集转化细胞而淘汰未转化细胞的问
植物遗传转化受体系统的建立是 基因工程的重要环节
1、植物遗传转化常用的受体 （1） 植物组织和器官：幼叶、未成熟 子叶、子叶、未成熟胚、成熟胚、子叶 节、子房、下胚轴、茎尖、花粉、球茎、 根和鳞茎等。
（2）中间繁殖体：
在离体培养过程中 形成的具有一定形 态结构的中间繁殖 材料。包括：原球 茎、根状茎、丛芽、 胚状体、愈伤组织 和悬浮细胞等。
2、根癌农杆菌Ti质粒转化的基本程序
（1）受体系统的 建立 （2）Ti质粒转化 载体的构建 （3）目的基因 的转化与鉴定
目的基因的转化程序
根癌农杆菌的培养、纯化、保存
Vir区基因的活化和工程菌液的制备 外植体的预培养、接种及与农杆菌的共培养 外植体脱菌及选择培养 转化体的选择和植株再生
转基因植株的鉴定
④农杆菌敏感性试验
选择对农杆菌敏感的受体材料是建立高效稳定转基因
受体系统的关键（农杆菌介导法）
不同植物材料
农杆菌菌株浸染 敏感性评价 （结瘤或发根率，发生时间，生长状况等）
（2）受体系统常见的问题及其解决途径
①再生能力及其遗传稳定性 选择合适外植体 减少继代次数 选择合适培养基等 ②愈伤组织褐变 ③再生植株玻璃化
采用一定的方法将目的基因导入细胞 转化细胞的筛选和植株再生 转基因植株鉴定和目标性状鉴定
二、植物遗传转化受体系统的建立
植物遗传转化受体系统是指用于 转化的外植体通过组织培养途径 或其他非组织培养途径，能高效、 稳定地再生无性系，并接受外源 基因的整合，对用于转化选择的 抗生素敏感的系统（王关林和方 宏筠，1998）
（3）原生质体
2、植物基因转化受体的条件 ●高效稳定的再生能力 ●较高的遗传稳定性 ●具有稳定的来源 ●对抗生素敏感 抑菌抗生素：在农杆菌介导的遗传转化 中用来抑制农杆菌生长的抗生素。 选择性抗生素：用来对转化子进行早 期筛选的抗生素
作为选择性抗生素的条件
■植物材料对所选用的抗生素有一定的敏感性