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细胞的抗原表位研究方法

细胞的抗原表位研究方

法

孙建宏,曹殿军

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黑龙江哈尔滨。。。

中圈分类号文献标识码文章月号摘要多表位疚苗有望成为预防多种病原体感

染的理想疫苗,因而被认为是将来疚苗的发

展

方

向杭原表位是研究杭原的免疫机制和表位疫

苗的基袖,近年来在表位研究方面取得了一些可喜的进展,特别是抗原表位的研究方法细胞表位的研究方法已经不局限于通过交叠合成多

肤进行研究,又诞生了噬菌体随机肤序以及表位

预浏等方法在细胞杭原表位的研究方面也

有了相应的预浏方法,尤其是将

试

验体外杭原提呈试验等应用于细胞表

位

活

性的鉴定,极大的促进了细胞表位的研究进

展文章全面系统地对细胞表位与细胞表位的研究方法的进展进行了综述旨

在

为

表位

和表位疫苗的研究提供先进的多种技术方法关健词抗原细胞表位细胞表位

表位又称抗原决定簇

垃

是指存在于抗原分子表面的能够决定抗原特异性的数个氨基酸残基组成的特殊序列及其空间结构

表位一般只占个氨基酸和单糖残基的大小至多

不超过个氨基酸残基根据与抗原受体结合不同分

为细胞识别表位和细胞识别表位起关键作用的表位称为显性表位或称免疫优势表位但是最近

有人提出免疫优势表位和保护免疫反应之间没有直接

的关系在用结核菌素次优势表位多肤免疫时提供了与卡介苗免疫同样的保护效果其中的机理还有待深人

研究

细胞抗原表位

对于抗原表位的研究曾因为缺少检测技术及肤合成技术等困难而一度陷于停滞状态随着单克隆抗体技术计算机技术和固相合成肤技术的日臻成熟对细胞抗原表位的研究已经取得了很大进展研究细胞抗原表位的方法也得到了相应的发展和完善

近年国际上医学界对细胞抗原表位研究的较

多特别是对型流感病毒的细胞抗原表位已有较为深人的研究蛋白基因连续突变是导致抗原变异的主要原因现在确定的抗原表位有个但

是流行株至少有个表位发生变化因此根据各型抗原表位比较研究找出各型高度保守的细胞及细

胞表位并结合蛋白和蛋白的优势表位构建

多

表位重组疫苗将是流感疫苗的重大突破目前

国外已经有以型流感病毒蛋白的和细

胞识

别表位联和制成的合成肤疫苗可以保护鼠的致死性感染的报道闺而且随着噬菌体展示技术的发展研制模拟表位疫苗将是疫苗研究的一个新的途径

对动物病原的细胞表位的研究也有较多报道其中等等研制的口蹄疫表位疫苗免疫后可保护猪抵抗强毒攻击而对于禽类病原细胞表位的研究目前还很少尚未有表位疫苗的报

道对于禽病原的细胞抗原表位的研究仅限于应用单克隆抗体和点突变技术例如对于和蛋

白抗原表位的研究应用该技术已经确定了蛋白上的个细胞抗原表位它们在溶血活性膜融合和病毒感染中起着重要作用而蛋白有个中和性抗原表位可刺激产生中和抗体〔闷

目前用于研究制备细胞抗原表位的方法主要有

以下几种

细胞杭原表位的预浏

法

该方法是近年来建立起来的一种较先进的细胞抗原表位研究方法这是人们在总结抗原表位与已知氨基酸序列的蛋白质某些结构特征关系的基础上得出的蛋白质细胞抗原位点位置的经验规则该法适用于已知一级结构的蛋白质或多肤抗原的线性表位的预测自从上世纪年代和提出

用亲水性参数对抗原表位预测的方法以来困目前根据

这些参数综合预测细胞抗原表位的计算机软件

已经

问世现已被人们认可并具有较好预测效果的方法主要有亲水性方案可及性方案,〕抗原性方案,可塑性

劝方案,〕二级结构预测

方案‘〕及电荷分布方案

对上述各种参数的预测比较表明各种方案预测的正确率均不高一般将上述多种方案综合考虑尤以可及性

方案可塑性方案抗原性方案及二级结构预测为重要就是说作为细胞蛋白抗原的表位首先应易位于或移

动于蛋白质抗原表面有利于与抗体结合并具有一定

柔韧性有很多应用这些参数综合预测细胞的表位

的成功报道如应用计算机软件对人免疫缺陷病毒分离

株的保守区和可变区的抗原表位预测〕对人氨

孙建宏等细胞的抗原表位研究方法

基酸序列细胞抗原表位的预测〕以及对恶性疟原虫

疟殖子表面蛋白一的表位分析〕等

根据细胞表位综合预测结果可以人工合成表位肤段或利用分子生物学方法扩增预测表位的编码基因片段后用表达载体表达相应的表位纯化后获得目的肤再利用或等方法对其

进行鉴定

化学或生物学

方法

有两种方法一种是用化学法或酶“切割”抗原获

得多肤片段再利用单克隆抗体筛选能与其反应的片段从而确定蛋白质的抗原表位〕该法获得的表位是线性表位水解后采用凝胶过滤离子交换等方法将水解片段分开然后用或等方法来检测另一种是水解抗原抗体复合物这是一个直接的确定线性及构象性细胞抗原表位的方法又称为其理论依据为抗原一抗体复合物的结合部位能抵抗蛋白酶的水解采

用化学“切割”法或酶法研究抗原表位过程比较复杂抗

原抗体结合的条件酶解的条件解离后的片段是否能有效分离解离的完全程度酶解片段的大小等对结果都会有影响肤探针扫描技术交叠合成多肤的方法

是应用肤合成技术合成连续重叠的一肤将这

些合成的肤与相应的抗体反应分析检测结果以确定

阳性反应片段这一技术要求有明确的抗原的一级结

构并且只能检测抗原线性表位该法曾得到广泛应用但是肤探针扫描技术和化学或生物学方法处理

抗

原获得多肤这两种方法都存在工作量大成本高等缺点因此使用的越来越少了应用噬菌体随机肤库研究蛋白质抗原表位

这是一种很有发展前途的研究蛋白质抗原表位的技术近年来的抗原表位研究成果是发现了模拟表位叩模拟表位的氨基酸顺序可能与大分子抗原表位的氨基酸顺序截然不同却可以引起相同特异性

的强免疫反应应用噬菌体随机肤库获得的表位就是模拟表位该法是利用基因克隆技术将合成的一组寡核昔酸混合物小肤基因混合物克隆至线性噬菌体基因组中

使之以融合蛋白的形式在噬菌体的外壳蛋白的氨基端表达从噬菌体随机肤库筛选抗原表位的基本原理是生物淘洗一般经过轮的筛选并且

每次增加筛选强度这样就可以获得与单抗结合较紧密的噬菌体克隆通过序列分析就可知道噬菌体克隆所携带的外源肤序列从而得知该单抗所针对的抗原表位这种噬菌体表位文库构建的成功与否噬菌体克隆的数目是一个决定因素以随机六聚体氨基酸为例亿种左右的序列编码大约万种

的氨基酸序列因此要使所有可能的氨基酸序列都包含在文库中至少需要亿个独立的克隆才行考虑

到密码子的简并性一般一亿个独立克隆的表位文库就能顺利地进行下一步的筛选其最大优点是

可以

获得构象型表位该方法的不足是首先目前所建的

肤库只能达到构建大片段的肤库很困难其次有些肤由于过于疏水或者由于影响外膜蛋白的折叠而不能在噬菌体外正确表达等〕应用该方法获

得的囊尾勤模拟表位可产生对囊尾勤的保护性抗体,杜

勇等人〕应用特异性血清淘洗和正常血清吸附筛选

到了一个的模拟表位其具有良好的免疫原性

此外还有一些如复合物的射线衍射和

核磁共振分析等方法,在细胞抗原表位研究中也有所应用在研究抗原表位中的个别氨基酸在表位中的作

用一般采用定点突变技术

细胞表位

细胞表位就是抗原蛋白中经抗原提呈细胞

处理由分子提呈给淋巴细胞受体的多肤片段可分为类分子抗原表位即细胞抗原表位和类分子抗原表位即细胞抗原表位确定细胞表位对

于研究细胞免疫的机理过程及研制亚单位多肤疫苗和基因疫苗具有重要的意义但是细胞不象细胞可以直接识别抗原表面上的表位而只能识别结合

到

和分子上的肤因此对于细胞表位

的研究多是从分子人手目前对于人的细胞

表位研究较多如人的免疫缺陷病毒西尼尔病

毒和分支杆菌等的细胞表位而且已经有关

于将多个同源或异源的细胞表位串联诱生了细胞

免疫应答或将细胞表位和细胞表位组合在相应动物模型中诱发体液免疫应答细胞免疫应答和辅助细胞的免疫应答的表位基因表位合成肤的报

道〔而对于禽类病原的细胞表位的研究由于缺少预测的工具和必要的检测试剂相应的细胞表位的检测方法也不很成熟因此还没有这方面研究的报道研究细胞表位

的方法

目前研究细胞表位的方法主要有

合成重叠肤法即在合成重叠的肤后通过细胞功能试验确定可以被细胞识别的肤段即细胞表位尽管应用该方法成功鉴定了几个细胞表位但是这种方法有其局限性不但工作量大费用高而且由于合成的重叠肤一般是个氨基酸长个氨

基酸重叠因此重叠区之间的表位就可能被忽略了所

以不能够鉴定出目的蛋白上所有的细胞表位

细胞表位预测法即根据细胞表位的特

征先预测表位再合成肤段以细胞功能试验

等进

行鉴定目前已经有细胞表位预测的计算机软件在类分子抗原表位预测方面有很多种预测方

法这些方法可以概括为种类型①根据模型预测根据用已构建的模型已成功的预测了一些病原体的抗原表位山〕但并不是所有预测的抗原表位

都能与类分子结合等〕研究与抗原肤的作用发现用以往文献报道的方法

预测抗原表位仅有的肤能与结合如果除了考虑锚点即肤上受限制对抗原肤和的结合至关重要的位点之外还应考虑其它位置氨基

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