/. 多糖的生物活性及制备工艺研究 摘要： 多糖是一种自然界中含量丰富的生物大分子，其具有复杂的结构及多方面的生物活性功能。本文综述了多糖的一些主要生物活性，如抗炎、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、抗补体等药理作用，以及多糖的提取、分离纯化等制备工艺的研究。其大致流程包括活性成分的确定、对原料药物的预处理、最佳提取分离工艺的选择、对粗品的提纯及纯化、精制多糖成品、多糖组分分析等。虽然近几十年来多糖研究取得了很大进步，由于其结构的复杂性增加了研究的难度，因此多糖的分离纯化方法发展依然缓慢，很多技术环节仍有待发展。 关键词：多糖；生物活性；制备工艺；提取；分离纯化
多糖是一类由酮糖或者醛糖通过糖苷键连接而成的，为一种天然高分子多聚物，其在自然界含量丰富。多糖及其复合物是来自于高等植、 动物细胞膜和微生物细胞壁中的自然界含量丰富的天然大分子物质之一，与人类生活紧密相关，对维持生命活动起着至关重要的作用"和蛋白质、核酸、脂类构成了最基本的4类生命物质[1]。本文就国内外多糖的提取工艺方面作一综述，为进一步研究其生物活性奠定基础。 1 多糖的生物活性
1.1抗肿瘤作用 具有抗肿瘤活性的多糖大多是无毒性且具有诸如诱导细胞分化、刺激造血、抗转移[2]、抗新生血管生成[3]和诱导NO产生[4]等生物活性。它们大多不直接作用于肿瘤细胞，而是通过激活机体的免疫系统起作用,即促进淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞的成熟、分化和繁殖[5]，同时活化网上内皮系统和补体，促进各种细胞因子的生成[6]，最终抑制肿瘤细胞的生长或导致肿瘤细胞的凋亡。 1.2 抗病毒作用
20世纪70年代以后发现有些多糖具有抗疱疹病毒及流感病毒作用，特别是80年代发现多糖具抗艾滋病病毒(HIV)作用。 1.3 降血糖作用 多糖是有10个以上单糖缩合去水，以糖苷键形式结合形成的多聚糖。它与单糖、寡糖的性质不同，不但不会使血糖升高,而且能降低血糖。有望成为一类新的降血糖药物。 1.4 抗补体作用 /. 补体系统是人体的重要免疫防御系统之一，但过度激活会引起诸如类风湿关节炎、重症非典型肺炎(SARS)等许多疾病。至今尚无理想治疗药物，因此临床上急需高效低毒的补体抑制剂药物。
2 多糖的制备工艺流程 2.1 多糖的预处理 2.1.1 净制 取新鲜的样品，用刷子将其表面的泥沙刷去。 2.1.2 清洗 将样品经少许石油醚脱表面油脂，用去离子水洗涤至中性。 2.1.3 干燥 用真空冷冻干燥的方法干燥，或者干燥箱中干燥，干燥应以恒重为准。 2.1.4 粉碎 粉碎应过40目筛子，费穗成适当的粉末后备用。 2.1.5 样品脱脂 取干燥的粉未样品，用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取各6h以除去脂肪。 2.1.6 酶处理 准确称取一定量的脱脂粉，按α-淀粉酶与茯苓脱脂粉质量比为1︰10的比例加入α-淀粉酶，按一定的料液比置于三角锥形瓶中，放置于一定温度的恒温水浴锅中酶解30 min。 2.1.7 灭酶 置于90 ℃水浴20 min。 2.2 多糖的提取 多糖既可存在细胞壁外， 又可存在细胞壁内中，因此，从动、植物中提取多糖，首先就要对细胞进行破碎处理，使多糖从细胞中容易释放出来。因破碎后的细胞，其中含有脂类物质，容易连同多糖被提取出来，故需预处理。 一般采用醇和醚类物质浸泡或回流提取来除去脂质，此时一些脂溶性色素也容易被除去， 脱脂后的样品再用于多糖的提取， 以水、盐溶液、稀酸及稀碱在不同条件下提取。提取液浓缩后经透析、沉淀、干燥得到粗多糖。近年来，微波、超声和酶法辅助提取技术也开始应用于多糖的提取[7-8]。 /. 存在于细胞壁中的多糖，按照溶解度的不同又分为水溶性多糖和碱溶性多糖［9］。通常采用水提醇沉法、碱提醇沉法提取。 水溶性多糖的提取主要与提取次数、时间、固液比及温度等因素有关。随着提取次数增多，多糖的浸出率明显增高，但提取次数不易过多，一般为两次。虽然提取时间延长可提高多糖的浸出率，但浸提时间过长，将造成提取工艺延长。同时，还有可能增加杂质的溶出，通常选3h。碱溶性多糖的提取一般在4℃下进行，其影响因素除以上几点外，还与碱浓度有关，常采用0.5mol/L。在乙醇沉淀步骤中，浸提液浓缩比及乙醇加量是影响多糖沉淀率的主要因素。 2.2.1 水提醇沉法 称取一定量样品粉末→热水浸提→抽滤→滤液减压浓缩(浸提液∶浓缩液=10∶1) →95%乙醇沉淀（含醇量达80%）→于冰箱中静置过夜→离心→沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤→真空干燥得药物多糖粗品［10］。 该法采用水作为溶剂，具有价廉、无毒、操作安全等优点，其缺点是浸提时间长且提取率较低。 2.2.2 稀碱浸提法[11] 取样品粉末15g溶于3℃的015molPL NaOH 3000mL液中,搅拌至粉末溶解,此时溶液呈粘稠状态。5℃以下冷藏,过夜,抽渣弃去,滤液以10%的醋酸液中和至酸性,再加入等量95%乙醇,于3℃放置过夜,滤取沉淀,流水透析两天,再依次用蒸馏水、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后,减压抽干,置干燥箱中60℃以下干燥,即得样品多糖粗品,呈淡黄色细颗状结晶。该法提取率较水提醇沉法高，但浸提程序较繁琐，浸提条件较剧烈，极易破坏多糖的立体结构，使其生物活性受到限制。 2.2.3 酶解+热水浸提法[ 12 ]
将一定量的样品粉末加水浸泡30min(复合酶加水在40℃活化10min)→加入复合酶在48℃(PHS)浸提90min→中和后加水再升温至80℃继续浸提90min→乙醉醇沉,无水乙醉、丙酮、乙醚分别洗涤→获多糖粗品。酶解法可以在较低的温度下提高多糖的提取率，与传统的热水浸提法相比，浸提时间缩短，得率提高，是水溶性多糖的好方法。 2.2.4 发酵醇沉法[13]
发酵醇沉法提取多糖包括胞外多糖的提取及胞内多糖的提取，，前者将菌丝提取摇瓶培养10d，分离发酵上清液，在上清液中加入3倍量的95%乙醇，过夜,过滤得沉淀。沉淀相继用乙醇、丙酮、乙醚洗涤，得胞外多糖。后者包括胞内水溶性多糖及碱溶性多糖的提取，水溶性多糖的提取:取有机溶剂处理（脱脂）后的菌丝体粉末采用水提醇沉法进行提取；碱溶性多糖的提取:将上述提取水溶性多糖后的菌丝体滤渣用5 倍量0. 5 mol/L 的氢氧化钠溶液浸提，步骤同稀碱浸/. 提法。液体发酵具有易于操作、节约资源、产率高、周期短、可大规模投入工业生产等优点，已逐渐成为获取多糖的主要方法［14］。但研究表明［15］，发酵菌丝体中总多糖的提取率较天然菌丝低，这可能因为发酵菌丝体多糖的提取工艺不完善，有待进一步优化，也可能由于发酵菌丝体中总多糖占总糖的比例低于天然菌丝。 2.2.5 微波、超声波辅助提取法 微波提取法利用加热导致细胞内的极性物质温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞，进而出现裂纹，从而使胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放出胞内产物［16］。称取10g的样品粉末,溶解于500mL的溶液中,提取30min,在42%的微波占空比下回流提取后滤过,残渣依法再提取两次,合并滤液,低温浓缩至50mL。该法具有受热均匀、快速、高效、安全、节能等优点，近年来，普遍应用于多糖的提取。超声波提取技术也是近年来发展起来的一种提取生物活性物质的方法，具有方便、快速、提取物活性高的特点。赵声兰等［17］采用超声波法提取多糖，但提取率不高，最高达到1.6%。 随着医药、化学以及生物学的不断发展，多糖的提取取得了很大进展，酶+热水浸提法显著提高了多糖的提取率，同时缩短了提取时间。然而，水溶性多糖的提取率仍较低，一般不超过6%，因此，有必要进一步改进多糖的提取工艺，提高提取率。同时，应深入研究液体发酵生产多糖的方法，从而节约资源，适应大规模工业化生产的要求。然而对于微波、超声波辅助提取法由于该法具有受热均匀、快速、高效、提取物活性高等特点正处于快速发展阶段，越来越被人们所重视。 3 多糖提取液中杂质的去除
3.1 Sevag法除蛋白 粗多糖溶液加入Sevag试剂(氯仿:异戊醇=3:1混合摇匀)后，置恒温振荡器中震荡过夜，使蛋白质充分沉淀，离心(3 000 r/min)分离,去除蛋白质。脱游离蛋白后，上葡聚糖凝胶柱分离纯化。选用Sephadex G-15葡聚糖凝胶，将已充分膨胀的葡聚糖凝胶湿法装柱，用氯化钠水溶液进行平衡。样品上柱后，用蒸馏水洗脱，分部收集。洗脱液经不同浓度乙醇沉淀,离心，干燥沉淀即得较为纯化的树舌多糖Ga-1、Ga-2、Ga-3 3个级分和茯苓多糖Pc-1，Pc-2,Pc-3 3个级分。 3.2 沉淀洗涤
沉淀中加入一定比例无水乙醇，离心、去上清；加入一定比例丙酮，离心、去上清；加入一定比例乙醚，离心、去上清。 /. 4 多糖的纯化[18,19-23] 多糖的纯化是指将复杂的混合多糖分离纯化变成一个个单一的多糖。 4.1 分步沉淀法 它是根据不同的多糖在低级醇或酮(通常是乙醇或丙酮)中具有不同溶解度而进行分离。分子量大的多糖较分子量小的多糖在乙醇(或丙酮)中的溶解度小,所以逐步加大乙醇(或丙酮)的浓度可将不同分子量的多糖分别沉淀出来。 4.2 盐析法 它是根据分子量不同的多糖在一定浓度的盐溶液中具有不同溶解度的性质分离各种多糖。在多糖中加入中性盐(如NaCl、KCl、(NH4)2SO4等)至一定浓度,则在该盐浓度时溶解度最小的多糖便沉淀析出,然后上清液继续加盐至更高浓度,则另一多糖又沉淀析出。盐析法在蛋白质纯化上用得很多。 4.3 属络合法 根据不同多糖能与各种铜、钡、钙和铅离子形成络合物而沉淀的性质进行多糖的纯化。常用的络合剂有氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。得到的络合物沉淀经水充分洗涤后,用酸分解,得到游离的多糖。在多糖的纯化中最常用的是铜盐络合法及氢氧化钡络合法。 4.4 有机盐沉淀法 2000年美国专利(US75920000111)报道从植物与微生物中提取粘多糖或蛋白多糖的方法,其在多糖溶液中加入有机酸单宁使其与多糖形成有机盐复合物而沉淀。离心,沉淀用有机溶剂或其他物质使多糖复合物中的单宁除去。 4.5 季胺盐沉淀法 根据长链季胺盐能与酸性多糖或长链高分子量多糖形成络合物,在低离子强度的水溶液中不溶解的特性,使其沉淀析出,然后增加溶液的离子强度到一定范围,络合物则逐渐离解,最终溶解。 4.6 柱层析方法 柱层析方法是目前多糖中应用最多的方法,原因是效果好,操作简单。主要分为纤维素柱层析和阴离子交换柱层析。 5 干燥
将醇沉物置于60 ℃恒温干燥箱中进行干燥，干燥后的产物即为多糖。 6 组分分析 称取少许的多糖(0.1克)于2.0 ml离心管中，加入1 M的硫酸1 ml，沸水浴水解2 h，然后加氢氧化钡中和至中性，过滤除去硫酸钡沉淀，得多糖水解澄清液，以此进行点样；薄层层析法一般只展开1次，为达到较好分离效果,实验