高级微生物学结课论文 院 系 级 别 学 年 学 期 姓 名 学 号 类 别 ②全日制硕士 （①全日制博士 ②全日制硕士 ③教育硕士 ④高师硕士 ⑤工程硕士 ⑥农推硕士 ⑦兽医硕士 ⑧进修)

2014年 12 月21日 昆虫病原性真菌研究进展 摘要 昆虫病原性真菌是引起昆虫外源侵染性疾病，甚至控制昆虫行为的一类真菌。昆虫病原性真菌的寄主范围广，在行为及毒力方面的表现千差万别。在人类漫长的发展史中，病虫害防控的手段也逐步从化学手段晋升为生物手段，这也是昆虫防控领域的研究方向逐渐向生物杀虫方面过渡的重要原因。但迄今为止，在昆虫的合理开发应用方面，人们在相关领域的研究还不够明晰。本文对现行研究的昆虫病原性真菌的生物学分类、杀虫功能发挥的机制及基因工程研究方法三方面进行了讨论与总结，为病原真菌的毒力发挥、参与杀虫剂情况做相应评论及阐述。

关键词 昆虫病原性真菌；生物杀虫；毒力发挥；基因工程改造；应用前景

Abstract: Entomopathogenic fungi can cause exogenous infectious diseases within plenty of insects,which vary considerably in their mode of action and virulence. During the long profound development history of mankind, the attempts to control insects have changed over time from chemicals to natural control methods. This is why the development of natural methods of insect control or biopesticides, is preferred.There is no doubt that insects have been used for many years, but their reasonable and effective use in the field remains elusive. In this article, the biological classification, pesticide mechanism and novel genetic research methods were discussed, and also current study about virulence present and pesticides production. Key words: Entomopathogenic fungi; biopesticide; genetic project improved methods

1 前言 昆虫病原真菌是指那些在寄主正常生理条件下能直接侵入体内、增殖和迅速引起死亡的类群。它们以吸收血淋巴中的养分、分解寄主组织或产生有毒代谢产物而杀死昆虫。在引起昆虫传染性疾病的致病微生物中，由真菌引起昆虫死亡的情形最多，约占60%。对虫口密度起着重要作用。被真菌感染后，昆虫虫体能引发一系列病状，如虫体僵硬，取食倾向下降，甚至行为受到真菌操控。从根本上说，侵染成功与否取决于真菌在寄主体壁的粘附和穿透能力。昆虫病原性真菌产生毒素的过程包含四个步骤：附着、萌发、分化、穿透，它们决定着最终病原菌的致病性。昆虫体壁降解的同时一系列胞外酶也大量合成。通常粘附时会分泌粘液，酶、植物凝集素、疏水作用与静电作用也同样重要。能否粘附成功是判断病菌致病性的标志。粘附成功后，酶解和水解作用将昆虫表皮溶解。比较重要的酶类有脂肪酶、蛋白酶、几丁质酶，酶类随体壁成分的更替有序的分泌。病原菌物从急性致死到完全寄生以各种不同方式在昆虫体内寄生并诱发病症。它们以寄主生存所需的营养为生，有的甚至对寄主产生致命性危害，昆虫被感染后进而以流行病方式传播，最终导致种群数量降低。昆虫病原性真菌的寄主范围十分广泛，包括鳞翅目、幼虫、蚜虫、牧草虫，但只针对特定的寄主，对非靶生物或益虫的命中率很低。因而在世界范围内被大力推广。 昆虫病原性真菌能产生对昆虫致命的毒素，利用该良好特征，不少学者提出生物杀虫的概念。昆虫病原性真菌与传统的化学杀虫剂相比，在效率与成本方面更占优势。除效率高之外，应用生物杀虫剂还有很多优越之处，如对人体无毒，专一性强，食品中残留量少，不引起生态系统中生物多样性的紊乱等。到目前为止，有13个种或者亚种的昆虫病原真菌已经被登记和注册为真菌杀虫剂和真菌杀螨剂，其中大多数成分包括子囊菌中的绿僵菌和白僵菌。在美国，绿僵菌的成分被商业化，并用于控制甲虫，苍蝇，蚊子，白蚁，蓟马，和扁虱。其他几个国家将绿僵菌的几个菌株开发成生防试剂，并大规模释放，以应对蚱蜢，蝗虫，金龟子，沫蝉，蛴螬和蛀虫。 由于目前昆虫病原性真菌在杀虫方面的使用率仍不及化学杀虫剂，因而其商业发展也受到了一定限制。我们已经证实在绿僵菌中编码节肢动物神经毒素的基因的表达能加强病菌的毒力，我们也培育出了一种能合成单链抗体片段的绿僵菌菌株，它能阻止疟疾的传播。重组抗体提供了一大批潜在的抗昆虫效应物，这些效应物与亲本野生型菌株相比具有高度专一的生物杀虫结构，且能将对环境的负面影响降至最低。

2 分类 真菌是最常见的昆虫病原菌，十分适用于生物杀虫剂的制造。至少90个属，700个种以上的真菌是昆虫病原性真菌。除高等担子菌外，其余病原性真菌菌分散于各个主要的真菌分类学科目中。昆虫病原真菌约占昆虫病原微生物种类的60%以上，主要集中在藻菌纲、子囊菌纲和半知菌类的真菌中，其中数量最多、最重要的是藻菌纲的虫霉目和半知菌类的丛梗孢目。1890年，美国第一次用白僵菌防治麦长蝽，至今已有一百多年的历史，此后许多国家如日本、前苏联、巴西、英国等也开始应用白僵菌、绿僵菌、黄僵菌等防治农林害虫。目前在昆虫病原真菌中，研究最多的是白僵菌，其次是绿僵菌、拟青霉、曲霉菌、虫霉菌、菜氏蛾霉、汤氏多毛菌、赤霉菌和虫生藻菌等。 2.1 白僵菌 白僵菌是发展历史较早、普及面积大、应用最广的一种昆虫病原真菌，属半知菌类，主要用于防治玉米螟和松毛虫，其寄主种类达15个目149个科521个属707个种，还可寄生13种螨类。白僵菌不仅田间残效长，而且在越冬期仍有36~55%幼虫被寄生，以致来年不能羽化。这样，连年使用可大大降低虫量，这是其它药剂所不能比拟的。据资料报道，在前苏联主要用它防治马铃薯甲虫，美国用于防治森林害虫，而我国用它防治的害虫种类达40种以上，其防效在80%以上。 2.2 绿僵菌 绿僵菌是最早用于防治农业害虫的真菌，属于半知菌类，能寄生昆虫的8个目，30个科约200多种，也能寄生螨类，可诱发昆虫产生绿僵病。目前，我国已有绿僵菌杀虫剂工业化生产，产品产孢量50亿个/g，萌发率91%.用含孢量2亿/ml绿僵菌粉防治杨天牛，防效可达70%以上。[3-4]中国农科院生防所用绿僵菌防治东亚飞蝗，室内处理后第10d死亡率为100%，并在1995年进行了田间试验，取得了较好效果，初步证明应用绿僵菌防治东亚飞蝗有很好的前景。樊美珍等用其防治柑桔吉丁虫也获得成功。 2.3 拟青霉 我国大田应用的拟青霉主要有淡紫拟青霉、粉质拟青霉和肉色拟青霉等。淡紫拟青霉主要用于防治大豆胞囊线虫和烟草根结线虫，其杀虫活性较高，发酵液有类似细胞分裂素的作用，可促进作物生长。目前，我国已进行工业化液体发酵生产，主要用于防治大豆胞囊线虫病，防效在60%以上。 2.4 曲霉属 曲霉属是一类分布广泛的真菌，它能生活在各种基物上，其中有一些种类与昆虫有密切的关系。已报道的可寄生昆虫的曲霉菌资源有黄曲霉、黑曲霉、亮白曲霉、青霉状曲霉、日本曲霉、寄生曲霉、白曲霉、灰绿曲霉和四脊裸胞壳等。其中，黄曲霉寄生甘蔗白螟，自然寄生率为6~8%，人工感染致死率达70~75%；四脊裸胞壳对蚜虫有很高的寄生率。 2.5 其他 包括座壳孢菌、多毛菌、虫霉、镰刀菌在内的其他病原性真菌也同样广泛施用于田间用于不同种类病虫害的防治。如：双座壳孢菌可防治剌棉蚧，将有粉虱座壳孢子座的柑桔枝叶挂在桔园中，防治柑桔粉虱寄生率达70~90%；以汤氏多毛菌对柑桔锈瘿螨、柑桔锈壁虱、柑桔全瓜螨，防效可达70~90%。

3 真菌毒力的发挥及杀虫机制 有关昆虫病原真菌致病相关基因的研究报道很多，病原真菌的致病机理极其复杂。已有的研究表明，成百上千的基因可能与致病相关，并且致病相关基因的表达受不同侵染阶段昆虫病原真菌与外界环境或寄主环境互作的调控。 3.1 粘附与识别 昆虫病原真菌的侵染孢子主动弹射或随水流、气流被动转运，附着在寄主的表皮上。真菌孢子对寄主的粘附与识别可能与昆虫体表结构和成分、真菌孢子表面结构和成分有密切关系。早在1988年Boucias等就从球孢白僵菌和金龟子绿僵菌孢中分离到与孢子附着有关的糖蛋白类。真菌在粘附时通常会分泌粘液，酶、植物凝集素，当然，疏水作用与静电作用也同样重要。能否粘附成功是判断病菌致病性的标志。粘附过后，酶解和水解作用将昆虫表皮溶解。比较重要的酶类有脂肪酶、蛋白酶、几丁质酶，酶类随体壁成分的更替有序的分泌。Wang和Stleger研究了金龟子绿僵菌孢子的粘着蛋白MAD1和MAD2，证明粘着蛋白MAD1是诱导产生的，在增加附着力的同时，调控septin等细胞周期调控有关基因的表达，影响孢子萌发和菌丝发育，为多功能蛋白。MAD的缺失推迟孢子的萌发和入侵昆虫后血腔中芽生孢子的形成，降低真菌毒力。而MAD2与孢子粘附植物表面有关，缺失后阻碍对植物的粘附，不影响对寄主昆虫的识别和真菌的致病力。由于昆虫和植物有不同的表面结构和成分，这表明，真菌对昆虫和植物具有特异的识别机制。 3.2 萌发与穿透 昆虫病原真菌一般从昆虫表皮侵入，侵染结构也就必不可少。观察到的特殊的侵染结构包括附着胞、穿透钉、穿透板、穿透菌丝等。昆虫体表的水分、离子、脂肪酸和营养成分等因素影响着孢子的萌发与行为。其中，蛋白酶的活力是影响真菌侵染力的重要因素。目前已经鉴定了许多真菌水解酶。昆虫病原真菌侵染寄主时产生的蛋白酶可分为外切和内切蛋白酶两大类。内切蛋白酶主要有金属蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、类枯草杆菌蛋白酶及胶原蛋白酶；外切蛋白酶主要有羧肽酶及氨肽酶。不同的病原真菌产生的蛋白酶在种类和数量上有所不同。萌发要求能吸收可利用的营养成分，且对体表的有毒化合物有一定抵抗能力。萌发后，芽管的末端或一端出现附着胞，呈膨大球形的结构或膨大的菌丝体结构。一段时间后，附着胞上会形成侵入寄主体内的侵染钉或穿透钉或穿透菌丝等结构，菌丝扩展也可以形成穿透板，真菌从此处进入寄主体内。 3.3 体内增值 昆虫病原真菌在寄主体内繁殖，必须利用寄主的营养，这会造成寄主昆虫衰竭死亡。昆虫中广泛存在一种贮存非还原性二糖－海藻糖，是血淋巴中最主要的糖源，约占80%-90%，海藻糖对昆虫有重要的生理作用。Xia等研究表明，绿僵菌侵入寄主血淋巴后，分泌海藻糖酶和酸性磷酸酶，降解海藻糖和有机磷等，产生小分子葡萄糖和游离磷酸，为绿僵菌生长繁殖提供碳、磷营养，从而导致寄主昆虫减少取食、活动变缓，最后衰竭死亡。