目前，随着老年人口的迅速增加[1]，衰老相关疾病发病率也在不断增长[2]。
生物体的衰老过程主要表现为机体组织和细胞中自由基累积。
自由基是正常代谢的中间产物，其反应能力强，可使细胞中多种物质发生氧化，损害生物膜，还可引发DNA 的损伤，进一步诱发肿瘤等疾病。
随着年龄的增长，人体的自由基防御能力减弱。
葡萄籽的提取物葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin extract，GSPE）具有增强心血管活性、抗氧化、抗衰老等多种生物活性和药理作用[3]。
GSPE用于食品中能有效清除体内自由基，防治与自由基相关的心血管等疾病[4]；在化妆品中使用也可使皮肤老化减慢[5]。
研究显示模拟自然衰老过程公认的研究方法是持续注射一定量D-半乳糖[6]。
本研究采用D-半乳糖建立小鼠衰老模型，检测葡萄籽原花青素对衰老小鼠的抗氧化功效，探讨葡萄籽原花青素的抗衰老作用，为其在抗衰老方面的应用提供依据。
1 仪器与材料1.1 仪器AE224电子天平（上海恒平）；SG-4054恒温水浴锅（上海硕光）；JJ-2高速组织捣碎机（上海净信科技）；XSP-9CA光学显微镜（上海光学仪器一厂）；Varioskan Flash全波长扫描多功能读数仪（美国Thermo Scientific公司）。
1.2 材料葡萄籽原花青素提取物（GSPE，陕西惠科植物有限公司，纯度大于95 %）；D-半乳糖粉剂（上海国药集团，批号：20061025）；维生素C注射液[华润双鹤利民药业（济南）有限公司，批号：H20023350]；超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒，丙二醛（MDA）检测试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒，羟脯氨酸（HYP）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号：20190514）。
1.3 实验动物雄性昆明种小鼠60只，20～22 g，购自西安交通大学医学实验动物中心，动物质量合格证号：SCXK（陕）2010-001，动物使用许可证号：SYXK （陕）2018-001。
温度22±2 ℃，相对湿度55 %±15 %，12 h:12 h暗/光循环条件下饲养。
2 方法2.1 动物分组及造模给药健康雄性小鼠60只，适应性饲养7 d，随机分为6组即空白组、模型组、GSPE低（100 mg/kg）、中（200 mg/kg）、高（400 mg/kg）剂量组、维生素C阳性对照组（100 mg/kg），每组10只。
将配制好的D-半乳糖溶液皮下注射于小鼠颈部（0.1 ml/10 g），空白对照组颈部皮下注射等体积的生理盐水，连续注射30 d致小鼠衰老。
造模同时各给药组灌胃给予相应浓度的药物溶液，空白对照组和模型对照组给予生理盐水20 ml/kg，每日1次，连续8周。
每周称重一次。
2.2 脏器系数测定末次给药后禁食24 h，称取小鼠体重。
眼球取血并分离血清。
处死小鼠，摘取肝脏、脾脏、胸腺组织，生理盐水洗净各脏器组织，吸水纸吸干水分后，称重，按下式计算各脏器组织脏器系数。
脏器系数=脏器重量（mg）/小鼠体重（g）2.3 肝脏、皮肤组织及血清生化指标检测眼球取血，3500 r/min离心20 min 后，分离血清，采用试剂盒测定各组小鼠血清中SOD、MDA、GSH-Px含量。
取小鼠肝脏和皮肤组织加入冰浴过的生理盐水制备10 %的组织匀浆2 ml，12 000 r/min 低温离心10 min，分离上清，采用试剂盒测定小鼠血清及肝脏、皮肤组织匀浆液中SOD、MDA、GSH-Px含量。
同时检测皮肤组织中羟脯氨酸（HYP）的含量。
2.4 肝脏组织切片观察取小鼠部分肝脏组织，固定于10 %甲醛溶液中，依次经80 %，90 %，95 %，100 %酒精脱水。
石蜡包埋，切片机切片，苏木素-伊红染色，中性树脂封片，显微镜下观察肝脏组织细胞形态的变化。
2.5 数据处理测定结果采用SPSS17.0进行统计分析，结果用±s表示。
组间比较采用单因素方差分析（oneway ANOVA）。
老龄化的衰老涉及机体多个组织和器官，是一种渐进的生理功能障碍过程。
D-半乳糖诱导的急性衰老模型，在生理、生化等指标上能有效模拟自然衰老，用量过大可引发机体产生氧化应激、细胞损伤、炎症反应等，加速大脑衰老和认知功能障碍[7]，出现心肌细胞钙超载、凋亡、心脏功能退化[8]，肝脏细胞复制性衰老、肝脏结构破坏、炎性细胞增多[9]、同时免疫系统也被破坏，胸腺、脾脏指数下降[10]。
本研究采用D-半乳糖注射建立小鼠衰老模型，观察GSPE对小鼠衰老的干预作用。
结果显示，GSPE可改善衰老所导致的脾脏指数、胸腺指数下降，与模型对照组比较，GSPE中、高剂量组脾脏、胸腺、肝脏指数显著改善，组织病理学结果显示，GSPE中、高剂量组肝
脏细胞结构清晰，细胞数量增加，说明GSPE对D-半乳糖诱发的肝脏细胞损伤也有抑制效果。
衰老会导致体内自由基防御系统逐渐下降，如SOD、GSH-Px等酶的活力下降[9]。
SOD是机体内清除自由基的主要物质，生物体中SOD的水平是象征着衰老和死亡的直观指标[11] ；GSH-Px是一种重要的体内过氧化物分解酶，是生物抗氧化能力的指标之一[12]。
测定SOD、GSH-Px酶活力变化可间接反应机体的衰老程度。
生物体中，自由基作用于脂质过氧化的最终产物是MDA，MDA的大量产生加重了细胞膜的损伤[13]。
本研究显示模型对照组小鼠血清、肝脏及皮肤组织中的SOD、GSH-Px含量显著降低，MDA含量升高，应用中、高剂量GSPE进行治疗后小鼠血清、皮肤、肝脏中的SOD、GSHPx 酶活性显著升高、MDA含量降低，进一步证明GSPE可通过对抗氧化应激反应改善衰老。
HYP是胶原纤维和胶原蛋白中主要的非必需氨基酸，是检测机体胶原代谢的重要指标，也是评价皮肤衰老的重要指标[14]。
本研究进一步测定了衰老小鼠皮肤组织中HYP的含量。
研究显示，与空白对照组比较，模型对照组皮肤组织中HYP的含量明显升高，用中、高剂量GSPE进行治疗后皮肤组织HYP的含量降低。
总之，研究结果显示GSPE具有抗氧化、预防衰老的作用，可为葡萄籽相关产品的开发利用提供更多的选择。