植物内生真菌的分离
一、实验目的
1.理解内生真菌存在的普遍性和多样性
2.掌握常规的微生物分离纯化方法
3.掌握分菌过程中的一些基本操作技能
二、实验原理
植物内生真菌( Endophyte) 是指那些在其生活史的一定阶段或
全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，而宿
主植物一般不表现出外在的症状。所有植物中几乎都存在内生菌. 由
于植物内生真菌与宿主在长期的进化过程中形成了特殊的生态关系，
因而内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的次生代谢
产物，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物越来越成为微生物次生
代谢产物的研究热点之一。
采用微生物学常规的组织分离法从植物中分离内生真菌
三、实验材料
板蓝根新鲜健康的叶片
试剂：次氯酸钠、无水乙醇、葡萄糖、琼脂、青霉素、 链霉
素
培养基：PDA培养基、分离培养基
四、实验步骤
(一)、配制PDA培养基
10月27号晚上:
(1)配置PDA培养基,用电子称称取去皮的土豆100g，煮沸30min，
4层纱布过滤，滤液加热，加入琼脂7.5克，琼脂完全融化后加入葡
萄糖10g，待稍冷却后加水至500毫升。
(2)准备10瓶无菌水，每瓶150ml左右。
(3)包好烧杯，培养皿，涂布棒等实验仪器，等待消毒。
(二)、配制分离培养基
28号中午：
（1）配置分离培养基，将PDA培养液均分成两份，一份备用，另一
份待高温灭菌后，加入青霉素100mg／L、链霉素200mg／L的混合
液20ml，即得到分离培养基。
（2）用消毒后的培养皿在通风橱中倒平板，注意在整个过程中保证
无菌操作。
(三)、采集新鲜板蓝根叶片
28号晚上到实验室外采集新鲜健康叶片完整的板蓝根叶片。
(四)、植物组织表面消毒
28号晚上将新鲜、健康的板蓝根叶片于自来水下冲洗干净，用吸水
纸吸干表面水分后剪成小段（片）做如下表面消毒处理：75%酒精漂
洗3min，无菌水冲洗4~5次，5%次氯酸钠溶液漂洗叶3min，无菌水
冲洗4~5次，无菌滤纸吸干水分。
（五）、接种并培养
28号晚上：
（1）将上述表面消毒后的材料剪切成 0.5cm 2 小块，放入含有
分离培养基的平板中（3块／每板）28℃恒温培养3~15天。最后一
次洗涤水涂布平板作为对照。
（2）取备用PDA培养液高温灭菌后，加入青霉素100mg／L、链霉
素200mg／L的混合液20ml，在通分橱中倒平板。
（六）、分离真菌
29号晚上：接种培养24小时后，观察对照组无细菌产生，说明实验
成功。
31号中午：继续培养2天后，实验组组织块边缘没有菌丝产生，放
入恒温箱继续培养。
11月1号中午：观察到实验组组织块边缘没有菌丝产生，放入恒温
箱继续培养。
11月2号晚上：观察到实验组组织块边缘有少量菌丝产生，及时采
用菌丝尖端挑取法将其转入另一PDA平板培养。
（七）、纯化
待分离培养基中长出真菌后，挑入斜面培养基中培养。