1.RT-PCR 测定PKCαmRNA 表达
用TRIZOL 一步提取法提取总RNA ,按Ivit rogen 公司Super Script First-st rand Synthesis For RT-PCR 步骤进行逆转录。
以β-actin 作为内参照。
引物序列, PKCα上游为5′-TGCTGACTTTGGGATGTG-3′, 下游为5′-
TGTTTGT2TCTCGCTGGTG-3′,扩增产物长度605 bp ;β-actin 上游为5′- TGACTTA GTTGCGTTACACCC-3′,下游为5′- CGAA
G2GCTCATCATTCAAAA-3′,扩增产物长度450 bp 。
RT 反应条件: 50 ℃ 30 min ,99 ℃ 5 min ,5 ℃ 5 min 一个循环。
PCR 反应条件: 94 ℃预变性2 min ,然后按照94 ℃ 30 s ,55 ℃30 s ,72 ℃ 1 min 进行30 个循环, 最后72 ℃延伸10 min。
2. Western blot 检测PKCα蛋白表达
（1）胞质、胞膜蛋白的提取:所有实验操作均在4 ℃下进行。
各样品取50 mg ,加入5 倍于湿重的粉碎缓冲液,剪碎、匀浆,4 ℃12 000 r/ min 条件下离心2 h ,上清液即为胞质蛋白。
将上述沉淀用2 ml 胞膜蛋白提取液悬起,超声粉碎后抽提30 min ,再于4 ℃12 000 r/ min 离心2 h ,上清即为胞膜蛋白。
将蛋白定量后,调定至等蛋白浓度备用。
（2）PKCα分析:取20μg 蛋白与等体积样品缓冲液混合,煮沸5 min ,十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶( SDS-PAGE)电泳,电转移至硝酸纤维素膜上, 5 %脱脂奶粉封闭3 h ,0. 1 % TTBS 清洗,加入PKCα 抗体、室温孵育过夜, 再用TTBS 清洗,以碱性磷酸酶标记的二抗室温孵育l h , TTBS清洗,与偶联辣根过氧化物酶的第二抗体( sigma) 反应,Western blot 增强化学发光法( ECL) 发光试剂显色并拍照。
采用图像分析仪分析蛋白条带灰度。
参考文献：孔垂泽，张哲，杨琦，孙丹，苗淼.蛋白激酶Cα在肾癌组织中的表达及临床意义
1.信号通路阻断剂法
阻断剂法是应用信号通路阻断剂( inhibitor) ,阻断其相对应的信号通路,再设立对照组或空白组,分别检测其相关生物学性状的变化,从而研究该信号通路的生物学作用。
2.蛋白质印迹分析(Western Blot)
利用Western B lot可以检测变化的蛋白质,进而推断出信号通路的变化及作用。
主要原理是:采用聚丙烯酰胺凝胶对被检测的蛋白质进行电泳,利用特异性抗体(一抗)与它所对应的抗原结合后,再用二抗使其显色。
通过分析着色的位置和
着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
阻断剂法需要的是特异性的阻断剂,Western blot需要的则是特异性的抗体(一抗) 。
3.聚合酶链式反应( Polymerase Chain Reac2tion, PCR)
RT - PCR技术的基本原理是:首先经反转录酶的作用由RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。
RT - PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中的基因表达水平、细胞中RNA的含量和直接克隆特定基因的cDNA 序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
Real - time PCR技术引入了一种荧光化学物质,其荧光强度会随着PCR产物的量变化而变化,可通过监测荧光来测定PCR 产物的量。
在PCR扩增期间,通过监测每一个循环荧光信号的强弱变化来即时测定特异性产物的量,从而实现对起始模板定性及定量的分析。
而且在整个过程中不需要取出PCR 产物进行电泳。
RT - PCR技术可用于半定量表达的检测,对基因的表达量进行比较,但不能检测PCR 信号放大之前的起始模板量; 而Real - time PCR技术则可以更精确的定量,在具体实验中可以根据需要来选择合适的方法。
4.RNA干涉(RNAi)
RNAi的作用机制可能是细胞内的双链RNA 在Dicer酶的作用下,形成小干扰RNA ( small interfering RNAs, siRNAs) ,siRNAs可进一步结合到核酸酶上并使其激活,从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA,完全抑制该基因在细胞内的翻译和表达。
5.荧光共振能量转移技术( Fluorescence rc-sonance energy transfer, FRET)
其主要原理是:应用荧光蛋白作为供体分子和受体分子,受到激发的荧光团可将能量通过偶极子- 偶极子作用将能量转移到另外一个受体,引起第二个荧光团的激发。
一旦发生了能量的转移,供体和受体之间必然存在供体荧光的淬灭和受体荧光活化的相关性。
而一些细胞因子在激活p38MAPK的过程中就有这种受体与配体之间的相互作用,就可以观察这个被激活受体和p38MAPK信号通路的相关性。
外界刺激因素向细胞内的信号传递一般认为是通过胞膜上的受体,当配体与受体结合后,引起受体构象变化或化学修饰,介导信号传递. 而FRET就可以用来研究受体和配体之间的相互作用。
基因芯片(Gene chip)
参考文献：解文博，叶玲.p38 丝裂原活化蛋白激酶信号通路的部分研究方法
免疫胶体金技术检测蛋白激酶定位
参考文献：张琳, 张璐, 朴英杰.应用改良的免疫胶体金包埋方法检测p38 蛋白激酶在Raw 细胞中的定位。