摘要：眼髂是最容易接触化按品及其成分的器官２一．眼莉激性评价是安全性评价技——化妆品眼束０
传统眼部觏激试验采用实验动物进ｔ动物极大的痛苦ｊ近年来．多种替１
—手广某些条件下，眼睛可能成为化妆品及其成分ｆ¨径．因而外源物质可能造成眼部的健康危害．
作用包括：眼及外周组织的局部刺激、损伤和炎症反应．过敏反应。眼深部的组织损伤，临床表现为眼部疼痛、刺痛、灼热、眼睑眨动、泪液增多．严重者引起不同程度的功能性损失，如角膜浑浊、水肿、甚至视力下降。正常情况下．眼睛很少直接接触外源物质、但在化妆品使用过程中．通常由于意外使化妆品以稀释的形式进入眼睛（例如香波），产生刺激作用。眼刺激性是指眼睛前表面直接接触受试物后引起的眼及其周围粘膜可逆性炎性变化眼腐蚀性是指眼睛前表面直接接触受试物后引起的眼及其周围粘膜不可逆性组织损伤。１
检测化学物的刺激性和腐蚀性的传统实验是由Ｄｒａｉｚｅ等提出的兔眼实验，目前仍是测定息性眼毒性的国际标准。近年来．在动物福利的压力下．一些优化的试验方法被提出。并陆续被验证和认可。除了经验证认可的替代方法外ＩＢＣＯＰ试验、ＩＣＥ试验、ＩＲＥ试验）．大多数化妆品公司将一些所４８谓“有效（ｖａｌｉｄ）”替代方法用于化妆品成品筛选。有效替代方法被定义为：还没有通过完整验证程序的技术．但存在足够多的丰斗学数据证明其相关性和可靠性。这些方法包括ＨＥＴ—ＣＡＭ测试、ＲＢＣ试验及ＮＲＵ试验。这些方法目前可作为危险识别的筛选工具，用于非风险评估过程。
ｉ．体—●曩■—量生■一体内眼刺激的发生机制表明．实验兔暴露受试物后最初几个小时（一般３小时）内。角膜的损伤程度可以预测眼睛损伤的持续时间和最终损伤程度。一般来说．轻度刺激物只影响表层角膜上皮．轻度和中度刺激物主要影响上皮和表层基质．严重刺激物能穿透更深的基质
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万方数据发挥作用，甚至可能是基质全部。而且损伤的可逆性和最初的损伤程度相关。角膜损伤程度（细胞损伤）和大体观察两者之间的相关关系．对于开发和验证预测眼刺激性的体外，离体检测方法提供了机理性基础。在所有可能影口自角膜损伤的动力学因素中．受试物的自身细胞毒性潜力排在第一位。那些可溶解细胞膜或者是导致蛋白质凝集的物质可立即产生细胞毒性。如表面活化剂和一些有机溶剂是这类物质的代表。那些作用于细胞能量代谢的物质也可快速产生作用．但可能没有第一类物质迅速。化学物质还可以通过对大分子的烷化或者其他影响而产生作用．这类物质的作用可能表现为一种迟发性的细胞毒性（如迟发性坏死或者凋亡）。体内眼刺激实验中受试物局部接触角膜和结膜．而实际情况下暴露的持续时间并不确定．可能从几分钟到几小时不等。角膜细胞层的分．从而对生理反应做出分类。目前
在不同的法规中有多种不同的评分系统，评价范围有最大单次组织计分和全部三种组织平均加权总分计分几种。对于化妆品的安全评估．加权总分、最大平均分（ＭＡＳ）和改良最大平均分（ＭＭＡＳ．不包括接触受试物后１小时的结果）均在使用。这些年来．为了减轻动物遭受的痛苦和使受损组织更快恢复．已经提出一些优化意见。例如低眼容量实验（ＬＶＥＴ）。目前．减少和优化的方法已经包括在试验策略中．作为动物试验的补充．而体内兔眼试验仅需要在最后一步进行．也就是说当全部其他序列试验已经得出阴性评价结果．需要对轻度到中度的刺激性混台物进行评价时才考虑性体内试验。
三．体丹■■方毒１９９１至１９９７年间在欧盟机构主导下．共进行了６项眼刺激试验的评价研究．对９项体外替代方法进行了评估。当时的结论认为没有一璎研究可以完全替代Ｄｒａｉｚｅ实验，但其中的一些实验作为跟刺激物筛选的方法或组合试验的一音Ｂ分可用于眼刺激试验的替代方法。后来经过持续改进．部分替代方法通过了ＥＣＶＡＭ、ＩＣＣＶＡＭ等验证机构的验证．２００９年．ＢＣＯＰ、ＩＣＥ和ＩＲＥ方法被ＯＥＣＤ认可用于替代眼镕Ｉ激试验。１牛角膜浑浊和渗透性实验（ＢｏｖｉｎｅＣｏｒｈｅａｌＯｐａｃｉｔｙａｎｄ
Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．ＢＣＯＰ）使用屠宰场获得的标本，将新鲜分离的角膜水平固定于支持架．然后放置于特殊改进的透光容器里。恒温条件下．封闭
蕊∞万方数据角膜将测试容器分为上下２个隔室．受试物添加于上隔室中，通过测量下室培养液的光密度｛ＯＤ）评估角膜的渗透性。测出的透光值和渗透值可用来进行体外分值计算。根据这评分系统可对受试物进行分类。ＢＣＯＰ可用于化妆品原料及成品的安全评怙．也可用于日用和工业用清洁产品、盥洗产品、杀虫剂等相关化学品和配方。８ＣＯＰ实验非常适合用于测试不同物理性状和溶解度范围较大的受试物，适用于鉴定中度、重度和极重度眼刺激性物质．但对区分轻度到极轻度的水平的刺激物似乎不太敏感，后者更适合用上皮样组织结构或者细胞毒性方法进行检测。欧盟ＥＣＶＡＭ和美国ｔＣＣＶＡＭ于２００７年通过对该方法的验证．２００９年成为ＯＥＣＤ正式试验指南（ＴＧ４３７ｌ。２离体免眼实验（ｉｓｏｌａｔｅｄｒａｂｂｉｔｅｙｅｔｅｓｔ．ＩＲＥ）．其原理是眼球接触刺激性物后，检测角膜透光值和角膜增厚（角膜肿胀Ｊ评价受试物的眼刺激性。从人道处死的实验免分离完整眼球，固定和直立维持于超渗容器中，滴八生理盐水使角膜保持湿润。试验时．将受试样品直接与眼球接触。暴露时间不定。例如鉴定严重刺激物接触１０秒．区分损伤程度较轻的受试物可接触１分钟或更长。去除受试物后．将眼球重新放入容器中．检查角膜透光值和角膜厚度。３０分钟和１、２、３、４小时后进一步评估。染毒３０分钟和４／Ｊｘ时分别检查荧光素渗透性。记录角膜透光值和荧光豪渗透性。根据获得的试验结果．通过不同观察指标的组合分析可对受试物的总体损伤做出评估。５０通常导致角膜水肿超过１５％的化学物可认为具有严重服刺激性。ＩＲＥ实验适合检测大多数类型的受试物．特别是用采筛选严重刺激性的物质（Ｒ４１）。ＩＲＥ实验主要用来预测角膜损伤，它不能提供受试物对结膜的作用或角膜损伤后的恢复。因此不能绝对认为ＩＲＥ实验中未观察损伤代表在体内也无作用。３离体鸡眼实验（ＩｓｏＩａｔｅｄＣｈｉｃｋｅｎＥｙｅ．ＩＣＥ）．ＩＣＥ是一种利
用离体鸡球短期培养进行眼刺激检测的体外方法．眼损伤通过角膜水肿、通透性和荧光素渗透进行评价。可用于评价腐蚀物和严重眼刺激物．或作为组合试验的一部分用于特定化学物质的法规分类的标识。其原理和具体操作过程类ｆ以于ＩＲＥ。角膜水肿、透光值和荧光素滞留的数值作为毒理学终点。平均最大分值用于对无刺激到严重刺激物进行分类，计算ＩＣＥ刺激指数．其范围从
万方数据圈．素■置舫蕾１鸡胚绒毛膜尿囊膜试验（Ｈｅｎ’Ｓｅｇｇｔｅｓｔｏｎｔｈｅｃｈｏｒｉｏ－ａｌｌａｎｔｏｉｃｍｅｍｂｒａｎｅ．ＨＥＴ－ＣＡＭＩ利用鸡胚绒毛膜尿囊膜结构与人结膜相似的特点，可用于眼刺激物或腐蚀物有鉴定。ＨＥＴ—ＣＡＭ试验系统主要测定３种反应．即出血、血管溶解和凝血Ｉ有时充血也可作为观寮指标）。受试物直接接触ＣＡＭ膜．于５分钟内评价上述三种指标的发生情况。使用最广泛的方法是反应时间法，测定３种反应终点每一种出现的时间。另一种方法是刺激闻值法，测定第一发观察到出现上述毒性终点的受试物浓度。第三种方法可用于不透明难溶解和固体受试物的检测．即将ＣＡＭ暴露于受试物一个固定时间（如３０秒或者５分钟Ｊ，ＪＪｗｂ冲洗除去受试样品后检查上述终点。大多数验证评估结论认为ＨＥＴ～ＣＡＭ实验和Ｏｒａｉｚｅ实验在评估原材料和化被品方面具有相关性。体外实验和体内实验在轻度和非刺激性受试物、表面活性剂和以表面活性剂为基础的配方等物质的测试中显
示较好相关性。但是，ＨＩ＝Ｔ－ＣＡＭ试验没有疆盖Ｏｒａｉｚｅ的最大平均分值（ＭＡＳ）的全部范围，对于固体、不溶性或粘稠物质的测试在实验结果的重复性方面鞍差，色素和染料可通过对ＣＡＭ染色而产生干扰。ＨＥＴ—ＣＡＭ实验可作为眼刺激性的筛选方法．用于配７５－／原料的安全评价中，确定可能的非刺激性或者轻度刺激物．有效的减少了动物试验。也可用于为管理目的进行的风险评估中和用于物质的标识和分类。ＨＥＴ—ＣＡＭ实验已被法国、德国、荷兰和英国的管理部门认可．用于严重刺激物的分类。２绒毛膜尿囊膜血管试验ｌＣｈｏｒｉｏａＩＩａｎｔｏｉｃｍｅｍｂｒａｎｅ
ｖａｓｃｕｌａｒａｓｓａｙ．ＣＡＭＶＡ）方法通过观察受试物对血管的作用评价潜在的眼刺激性．取１０天龄鸡胚．受试物直接接触ＣＡＭ的小片区域．暴露３０分钟后观察ＣＡＭ血管变化．例如出血或充血（毛细血管扩张）、血管消失（鬼影血管）．使５０％的受精卵出现这些损伤的受试物浓度被认为是毒性终点。ＣＡＭＶＡ］试验需要测定１０
；；ｉｌｌＯ万方数据ｐ个供试鸡胚出现５０％阳性反应所达到的剂量。水溶性和脂溶性物质都可用干检测。ＣＯＬＩＰＡ和美国ＣＴＦＡ等在内的多个机构组织的验证评估研究结果表明．ＣＡＭＶＡ方法和兔限刺激实验的最大平均分值（ＭＡＳ）值有很好的相关性．可正确将受试物分类为刺激物和非刺激物。ＣＯＬＩＰＡ的研究结论表明ＣＡＭＶＡ更遗台检测水醇类物质。总体上讲，适合作为化妆品和个人护理用品配方、醇类物质和表面活性剂的刺激程度的筛选方法。最适舍用于评价轻度到中度范围的刺激性物质．但不能用于严重刺激性物质的分类。３绒毛膜尿囊膜苔盼蓝染色试验（ｃｈｉｃｋｅｎｃｈｏｒｌｏａｌＩａｎｔｏＩｃｍｅｍｂｒａｎｅ—ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅｓｔａｉｎｉｎｇ，ＣＡＭ—ＴＢ）是经过改进的ＨＥＴ—ＣＡＭ方法。ＣＡＭ—ＴＢ试验克服了ＨＥＴ—ＣＡＭ实验缺乏客观性和难量化的缺点，通过测定ＣＡＭ吸收台盼蓝的量来检测受试物损伤作用。结果表明该方法ｂｂＨＥＴ—ＣＡＭ实验方法变异性低，而且和最大平均分值（ＭＡＳ）有很好的相关性。局限性与ＨＥＴＣＡＭ类似．有色物质可能干扰终点的测定。Ｓ２４重组人角膜组织模型（ＨｕｍａｎｃｏｒｎｅａＩｅＰｉｔｈｅＩｉｕｍｍｏｄｅｌｓ）ＥｐｉＯｃｕｌａｒ模型由美国ＭａｔＴｅｋ公司生产．由来源干正常人的表皮角质细胞生长于特殊制备的嵌八式细胞培养板中以无血清培养基制备而成．细胞分化形成的多层结构与角膜上皮相似。ＥｐＩＯｃｕｌａｒ试验与多项细胞毒性和刺激试验联台使用．主要是ＭＴＴ检测．也包括ＩＬ—ｌａ、ＰＧＥ２、ＬＤＨ和钠荧光囊渗透性检测。通过ＭＴＴ试验得出ＥＴ５０的值（使组织活性降低５０％的有效暴露时间）并与动物体内试验数据比较．可用于检测中度到极轻度范围内的眼刺激物。通过非常短的ＥＴ５０的值，该模型也可用于区分高中度和严重刺激物。目前该方法已在化妆品、个人护理、日化和化工企业的研究实验室和企业使用．用于确定受试物的毒性限■（如测定轻微作用水平剂量），或用于ｌ轻到中度眼刺激性）产品配方的Ｉ临床前安全性试验．以及用于配方优化、表面活性剂及奠配方的安全评估等。ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭＨＣＥ模型是由法圈ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ实验室开发．是将永生