第１９卷第４期　２０１０年Ｏ８月　中国组织化学与细胞化学杂志　

ＣＨＩＮＥＳＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＨＩＳＴＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＡＮＤ　ＣＹＴＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　Ｖｏ１．１９．ＮＯ．４　Ａｕｇｕｓｔ．２０１０　

假肥大型肌营养不良肌细胞抗肌萎缩　

蛋白的免疫组化研究　

宋　楠　杨晓凤　

（解放军四六三医院细胞治疗中心，辽宁沈阳１１００４２）　

［摘要］　目的研究假肥大型肌营养不良患者肌细胞中抗肌萎缩蛋白（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）的表达及其诊断意义。方法应　用针吸型活检术取１２１例假肥大型肌营养不良症患者（１０８例ＤＭＤ患者，１３例ＢＭＤ患者）的肌组织，采用ＨＥ染色观察　被检肌肉病理改变，免疫组织化学染色技术检测抗肌营养不良蛋白表达，以正常人肌细胞作为对照。结果　正常人肌细胞　膜上抗肌营养不良蛋白染色阳性，呈完整环形条带沿肌细胞膜分布；ＤＭＤ患者肌膜完全无显色；ＢＭＤ患者染色弱阳性，　可见沿肌细胞膜分布的间断表达。结论应用针吸型活检技术和免疫组化染色法检测抗肌营养不良蛋白，有助于ＤＭＤ和　ＢＭＤ确诊及鉴别诊断。　［关键词］　假肥大肌营养不良；　免疫组化；　抗肌萎缩蛋白　［中图分类号］　Ｒ４４６．８　（文献标识码］　Ａ　Ｄ（）Ｉ：１０．３８７０／ｚｇｚｚｈｘ．２０１０．０４．０１４　

ＩＭＭＵＮＯＨＩＳＴＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＳＴＵＤＹ　ＯＦ　ＴＨＥ　ＤＹＳＴＲＯＰＨＩＮ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＯＦ　ＭＵＳＣＬＥ　ＣＥＬＬＳ　ＩＮ　ＰＡＴＩＥＮＴＳ　ＷＩＴＨ　ＰＳＥＵＤｏＨＹＰＥＲＴＲｏＰＨＩＣ　ＭＵＳＣＵＬＡＲ　ＤＹＳＴＲｏＰＨＹ　Ｓｏｎｇ　Ｎａｎ，Ｙａｎｇ　Ｘｉａｏｆｅｎｇ　（Ｔｈｅ　４６３　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｐｅｏｐｌｅ　Ｓ　Ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ　Ａｒ　，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１００４２，Ｃｈｉｎａ）　

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉａｇｎｏｔｉｃ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ　ｏｆ　ｍｕｓｃｌｅ　

ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ　ｍｕｓｃｕｌａｒ　ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｍｕｓｃｌｅ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂ—　

ｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　１２ｌ　ｐａｔｉｅｎｔｓ（１０８　ＤＭＤ　ａｎｄ　１３　ＢＭＤ）ｗｉｔｈ　ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ　ｍｕｓｃｕｌａｒ　ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　

ｎｅｅｄｌｅ　ｂｉｏｐｓｙ．Ｔｈｅ　ｓｅｃｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＨＥ　ｓｔａｉｎ．ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ．　

Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ　ｉｎ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｎｏｒｍａｌ　ｍｕｓｃｌｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｍｕｓｃｌｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ｒｉｎｇｅｄ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｓｔｒｉｐｅｓ　ａｒｏｕｎｄ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｌｓ．Ｎｅｇａｔｉｖｅ　

ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｗａｓ　ｓｅｅｎ　ｉｎ　１０８　ｃａｓｅｓ　ｏｆ　ＤＭＤ．Ｔｈｅ　ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｗａｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｉｎ　１　３　ＢＭＤ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ　ｉｎ　ｍｕｓｃｌｅｓ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｎｅｅｄｌｅ　ｂｉｏｐｓｙ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｔｅｃｈ—　

ｎｉｑｕｅ　ｉｓ　ａｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓｉｎｇ　ａｎｄ　ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ　ＤＭＤ／ＢＭＤ．　

［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　Ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ　ｍｕｓｃｕｌａｒ　ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ；　Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ　

假肥大型肌营养不良是常见肌肉系统Ｘ连锁　隐性遗传病，表现为进行性肌肉萎缩，发病者多为　

男性，分为Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型和Ｂｅｃｋｅｒ型（ＤＭＤ／　

ＢＭＤ）。本病主要是由于位于染色体Ｘｐ２１．２肌细　

胞膜上的抗肌萎缩蛋白（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）基因缺失所　

致该蛋白的缺失或表达异常ｕ］，因此检测ｄｙｓｔｒｏ—　ｐｈｉｎ有助于疾病诊断和分类。我们针对从２００９年　

５月起治疗１Ｏ８例ＤＭＤ和１３例ＢＭＤ患者，首次　

应用改良式针吸型活检术取患者肌肉进行形态学观　察和抗ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ免疫组化研究，现将结果报告　

如下。　

［收稿日期］２０１０—０２　１０　［修回日期］２０１０　０４—０１　

［作者简介］宋楠，女（１９８０年），汉族，住院医师。　

＊通讯作者（Ｔｏ　ｗｈｏｍ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ａｄｄｒｅｓｓｅｄ）　材料和方法　

１．病例来源　收集解放军４６３医院细胞治疗中心住院的１０８　

例男性ＤＭＤ患者和１３例ＢＭＤ患者资料，均经临　

床症状、肌电图、血清酶谱和核磁共振等确诊。对　

照组为正常人肌肉组织。　

２．材料及试剂：抗ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ抗体购自Ｓａｎｔａ　

Ｃｒｕｚ公司，ＳＰ试剂盒及ＤＡＢ显色剂均购自福州　迈新生物技术公司，ＴＺ半自动活检枪购自北京德　迈特贸易有限公司。　

３．检测方法　３．１冰冻切片制备：应用针吸型活检术吸取患　

者股四头肌，经ＯＣＴ包埋剂包埋，液氮骤冷，置　

入恒冷式冰冻切片机切片，厚度均为８ｔｘｍ。　

３．２　ＨＥ染色：切片经甲醇固定，苏木素染色　

５ｍｉｎ，盐酸酒精分化后反蓝１５ｍｉ

ｎ，伊红染色　３７８　中国组织化学与细胞化学杂志　第１９卷　

３ｍｉｎ，经梯度酒精、二甲苯后中性树胶封片。光　

镜下观察结果。　

３．３免疫组织化学染色　

免疫组化检测ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ蛋白的表达：切片　经甲醇固定，３　Ｈ。Ｏ。溶液抑制内源性过氧化物　酶，ＰＢＳ洗涤３ｍｉｎ×３次；用５　的正常羊血清于　

室温下封闭非特异性抗原２０ｍｉｎ；一抗用ｄｙｓｔｒｏ—　ｐｈｉｎ抗体（１：１００稀释），放入湿盒内４℃冰箱过　

夜；第二天用ＰＢＳ洗涤３ｒａｉｎ　ｘ　３次，滴加二抗，　

室温孵育２０ｍｉｎ。用ＰＢＳ代替一抗作为阴性对照，　

以正常人的肌组织切片作为阳性对照。显色，脱　

水，封片观察。　

结果判定：ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ阳性反应位于细胞膜，　

呈棕黄色为阳性，不着色为阴性。　

结　果　

１．正常对照组：正常肌肉ＨＥ染色显示肌纤　维大小均匀，呈网格状排列，核位于肌纤维的周边　

（图１）。免疫组化结果可见肌细胞膜上出现强度均　

匀一致棕黄色完整环状条带，为ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ阳性　

表达（图４）。　

２．ＤＭＤ组：１０８例ＤＭＤ患者肌纤维ＨＥ染　

色显示肌纤维大小不等，外形变圆，萎缩和肥大肌　

纤维并存，大量细胞核内移，其间纤维组织增生，　

脂肪组织浸润（图２）。免疫组化结果显示肌细胞　

膜均无着色，为ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ阴性（图５）。　

３．ＢＭＤ组：ｌ３例ＢＭＤ患者肌纤维ＨＥ染色　

显示肌纤维同样存在大小不等，细胞核内移，但纤　

维组织增生和脂肪组织浸润的程度较ＤＭＤ组轻　

（图３）。免疫组化结果显示肌细胞膜上棕黄色颗粒　

状间断出现，强度不一致，部分存在，呈斑片状分　

布（图６）。　

图１　正常人肌肉组织ＨＥ染色（×４００），肌纤维大小均匀，呈网格状排列；图２　ＤＭＤ患者肌肉组织ＨＥ染色（×　

４００），肌纤维明显萎缩，少部分肥大，其外形变圆，细胞核内移，其间大量的纤维增生；图３　ＢＭＤ患者肌肉组织ＨＥ染色　

（×４００），肌纤维萎缩与肥大并存，细胞核内移，其间存在纤维增生；图４正常人肌肉组织冰冻切片ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ免疫组化染　

色（×４００），ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ蛋白阳性，肌细胞膜上可见完整的环形条带；图５；ＤＭＤ患者肌肉组织冰冻切片ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ免疫组　

化染色（×４００），ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ蛋白阴性；图６　ＢＭＤ患者肌肉组织冰冻切片ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ免疫组化染色（×４００），ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ　

蛋白阳性，强度不均一，间断表达　

Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ＨＥ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｕｓｃｕｌａｒ　ｂｉｏｐｓｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｍａｌｅｓ（×４００）．Ｔｈｅ　ｍｕｓｃｕｌａｒ　ｆｉｂｅｒｓ　ｈａｖｅ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｓｉｚｅ　ｗｉｔｈ　

ｇｒｉｄ—ｌｉｋｅ　ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ；Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ＨＥ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｕｓｃｌｅ　ｂｉｏｐｓｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＤＭＤ　ｐａｔｉｅｎｔｓ（×４００）．Ｔｈｅｒｅ　ａｒｅ　ａ　ｌｏｔ　ｏｆ　ｍｕｓｃｕｌａｒ　

ｆｉｂｅｒｓ　ｓｈｏｗｉｎｇ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ａｔｒｏｐｈｙ，ｓｏｍｅ　ｓｈｏｗｉｎｇ　ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ　ｗｉｔｈ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｕｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｆｉｂｒｏｕｓ　ｔｉｓｓｕｅ；　

Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ＨＥ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｕｓｃｌｅ　ｂｉｏｐｓｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＢＭＤ　ｐａｔｉｅｎｔｓ（×４００）．Ｔｈｅｒｅ　ｉｓ　ｃｏｅｘｉｓｔｅｎｃｅ　ｏｆ　ａｔｒｏｐｈｙ　ａｎｄ　ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ　

ｍｕｓｃｕｌａｒ　ｆｉｂｅｒｓ．Ｓｏｍｅ　ｍｕｓｃｕｌａｒ　ｆｉｂｅｒｓ　ｈａｖｅ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｕｓ；Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＩＴＩｕｓ—　

ｃｌｅ　ｂｉｏｐｓｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｍａｌｅｓ（×４００）．Ｔｈｅｒｅ　ｉｓ　ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｕｓｃｕｌａｒ　ｆｉｂｅｒｓ　ａｎｄ　ｓｈｏｗｉｎｇ　ａ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　

ｃｉｒｃｌｅ　ｓｔｒｉｐ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｕｓｃｌｅ　ｂｉｏｐｓｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＤＭＤ　ｐａｔｉｅｎｔｓ（×４００），　

ｓｈｏｗｉｎｇ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｕｓｃｌｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＤＭＤ　ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｅｈｅｍｉｃａｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　

ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｕｓｃｌｅ　ｂｉｏｐｓｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＢＭＤ　ｐａｔｉｅｎｔｓ（×４００），ｓｈｏｗｉｎｇ　ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｍｕｓｕｌａｒ　ｆｉｂｅｒｓ．　

讨论　薹　嚣篙　麓Ｄ儿童ｕｃｈ以ｅｎ　

假肥大型肌营养不良是一种常见肌肉系统ｘ　床上患者多出现双下肢和Ｉｇｔ肢近端开始的肌无力、