B-葡萄糖醛酸苷酶活性影响因素的探讨杨 光 (山东农业大学动物科技学院 泰安 271018)李振清 (滨州职业学院生物工程系兽医教研室)李建基 (扬州大学畜牧兽医学院) 摘要 探讨实验室条件下人工培植牛黄过程中,温度、pH值、钙、乙二醇等因素对B-葡萄糖醛酸苷酶活性的影响,结果表明,温度升高可显著提高该酶的活性(P<0.01),且在55℃时,其活性比在37℃提高近4.1倍;该酶的最适pH值为7.0;Ca2+在0.5～10m Mo l/L浓度范围内对该酶具有激活作用且与浓度成正比,在10mM ol/L时其激活作用最大;乙二醇在0.3～3M ol/L的浓度范围内对该酶具有激活作用,其最适浓度为1.5Mo l/L。
关键词 大肠杆菌 B-葡萄糖醛酸苷酶 温度 pH值 钙 乙二醇在人工培植牛黄的研究中,如何提高培植牛黄的产量和质量成为研究的热点。
牛黄中胆红素和胆酸含量是评价牛黄质量优劣的标准,因此促进胆汁中结合胆红素的水解和游离胆红素钙的沉淀是提高牛黄质量的关键。
埃希氏大肠杆菌可以产生B-葡萄糖醛苷酶(B-G酶),可作为牛黄菌种,其酶活性的高低对牛黄产量和质量有重大影响。
目前国内在牛黄菌种的筛选、驯化等方面报道较多,但在如何提高B-G的活性这一方面还鲜有研究。
为了探讨促进B-G活性的因素,为提高培植牛黄的产量和质量提供科学依据,特进行该项试验。
1 材料方法1.1 牛黄菌种采用5种血清型的大肠杆菌,编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ,其中Ⅰ、Ⅱ组为本院预防兽医学系微生物教研室提供;Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组为本课题组保存菌种。
1.2 试剂beta-GLUCOSIDASE:Worthington,批号, J1K697J;pHenolpHthalein m ono-B-g lucosiduronic acid:SIGM A,批号,229-896-3;酚酞(A.R.):上海化学试剂站分装厂,批号,871217;氯化钙(C. R.):天津市四通化工厂,批号,20020206;乙二醇(A.R.):上海试剂总厂第三分厂,批号,860919;氨基乙酸(B.R.):山东济宁化工研究所,批号, 890118。
1.3 仪器721-100型分光光度计(上海第三分析仪器厂产)、SY21-Ni型电热恒温水浴锅(北京长风仪器仪表公司产)、1702型电子分析天平(德国产)、7DL -40B型台式离心机(上海安亨科学仪器厂产)、JY99-2D型超声波细胞破碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司产)。
1.4 样品处理将5种血清型大肠杆菌菌种依次接种于10%、20%、30%、40%、50%、60%的自制胆汁琼脂培养基中进行耐胆汁驯化培养,再经营养肉汤培养基增菌培养后用超声波细胞破碎机处理15min,然后经3000r pm离心5min后,将上所得上清液置于5支试管内保存于-4℃冰箱中,作为酶源进行酶活性测定。
1.5 酶活性测定酚酞葡萄糖醛酸在B-G作用下分解为酚酞和葡萄糖醛酸,酚酞在碱性溶液中显红色,且红色的深浅与酚酞的量成正比。
通过比色法由标准曲线得出酚酞含量,然后按下式计算酶的活性单位。
酚酞量(L g)318.33×1000×1000ml0.2×1120=国际单位B-G活性用每分钟、每升检测样品水解底物释放出10-6mol的酚酞为一个国际单位。
具体操作步骤见表1。
1.6 不同温度条件下酶活性变化的试验在37℃、40℃、55℃3个温度条件下,用上述方法分别测定样品的酶活性,观察不同温度条件下酶活性的变化,从而确定最适反应温度。
1.7 不同pH值的系列缓冲剂中酶活性变化的试验在pH= 4.0～6.5的醋酸盐缓冲液、pH= 5.5～8.0的磷酸盐缓冲液和pH=3.0～4.5柠檬酸-磷酸二氢钾缓冲液这3种缓冲液环境中,分别测定样品的酶活性,观察其活性的变化规律,从而确定最适pH值。
4山东畜牧兽医表1 B -G 活性测定操作步骤 试剂(ml )空白管标准管对照管测定管1.pHeno l pHthalein mono -B -g lucosiduro nic acid ---0.012.0.2M 磷酸盐缓冲液pH=6.80.80.80.80.83.离心后上清液--0.010.014.55℃恒温箱保温2h 5.75%酒精停止反应1.0 1.0 1.0 1.06.酚酞标准液(0.1mg /ml )-0.02--7.pHeno l pHthalein mono -B -g lucosiduro nic acid --0.01-8.0.2M 甘氨酸-N aO H 缓冲液pH =10.4 2.02.0 2.02.09.加水至5ml,混匀10.记录光密度(O D 值),波长540nm以空白管为0以对照管为01.8 不同浓度的氯化钙溶液对B -G 激活作用的试验在0.5mM ol/L ～16mM ol/L 浓度范围内分别测定样品的酶活性,观察氯化钙溶液对B -G 的激活作用,同时,同一批样品在加入Ca 2+与不加入Ca 2+的情况下进行活性对比,得到的数据进行t 检验。
1.9 不同浓度的乙二醇对B -G 激活作用的试验在0.3M ol /L ～3M ol /L 浓度范围内分别测定样品的酶活性,观察乙二醇溶液对B -G 的激活作用。
在55℃、pH =5.5～8.0的磷酸盐缓冲液条件下,加入10mM ol /L Ca 2+和1.5M ol /L 乙二醇后,分别测定5种血清型大肠杆菌B -G 活性。
2 结果与分析55℃组B -G 活性为109.18±13.88,40℃组B -G 活性为101.30±12.74,两组间差异不显著(P >0.05),但都明显高于37℃组(29.23±10.70),差异显著(P<0.01);55℃条件下,B -G 活性是其在37℃条件下的3.7倍,而40℃条件下,B -G 活性是其在37℃条件下的3.5倍(表2)。
B -G 在pH =5.5～8.0的磷酸盐缓冲液其活性最高,在pH=7.0时达到最高峰值,其最适pH 值为7.0,其余两种缓冲液中均不能达到最高峰值。
Ca 2+在0.5～10m Mo l /L 浓度范围内对该酶具有激活作用且与浓度成正比。
在10mM ol/L 时其激活作用最大,超过10mM ol/L 后其激活作用反而减弱,反应体系中加入10m Mo l/L Ca 2+可使B -G 灵敏度提高22%;同一批样品在加入Ca 2+和不加入Ca 2+的情况下分别测定B -G 活性,差异极显著(P <0.01)。
表2 不同温度条件下B -G 活性(U /L )测定结果温度(℃)样品数量(n )平均活性(X ±SD )范围371029.23±10.7016.90～41.554010101.30±12.74*89.47～121.645510109.18±13.88*91.52～130.54注:表中标有*表示差异不显著(P>0.05),55℃组与40℃组之间差异不显著(P >0.05);37℃组与其他两组之间差异显著(P <0.01)。
表3 加入Ca 2+和不加入Ca 2+的情况下分别测定B -G 活性比较(U /L )处理样品数量(X ±SD )范围加入Ca 2+10107.49±41.1973.15～148.21不加入Ca 2+1089.45±34.0951.93～119.69注:经检验,加入Ca 2+和不加入Ca 2+两组样品B -G 活性差异显著,P <0.01。
乙二醇在0.3～3M ol/L 的浓度范围内对该酶具有激活作用,其最适浓度为1.5M ol/L,提高灵敏度47%。
Ⅰ、Ⅱ组牛黄菌种其B -G 活性明显高于Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组(P<0.01);而Ⅰ、Ⅱ组之间差异并不显著(P>0.05),Ⅲ、Ⅳ之间差异也不显著(P>0.05),但都明显高于Ⅴ组,差异显著(P <0.01),结果见表4。
表4 5种血清型牛黄菌种活性(L /L )组别ⅠⅡⅢⅣⅤB -G 活性(U /L )120.20±11.68A117.30±10.73A80.41±14.12B91.52±19.45B29.11±11.32C 注:标有相同大写字母的表示差异不显著(P >0.05),标有不同大写字母的表示差异显著(P <0.01)。
5试验研究3 讨论与小结许多研究资料表明,在牛黄形成的过程中,B-G 起着极为重要的作用。
M aki.T指出,B-G在胆汁中作用于结合胆红素(C.B.),使之水解为不溶于水的游离胆红素(U.C.B.)和葡萄糖醛酸,U.C.B.分子上的羧基、亚氨基等配位基团进一步与胆汁中的Ca2+、M g2+等金属离子配位结合,形成络合高分子化合物。
U.C.B.是否形成结石,直接取决于胆汁中U.C.B.与金属离子的浓度。
B-G活性升高可使胆汁中U.C.B.的浓度升高,从而有利于牛黄的形成。
因此,B-G活性是牛黄生产的关键因素。
在以往的研究中,测定B-G活性的反应温度均采用37℃,这样的温度条件下,B-G活性不高,不仅牛黄质量低,而且测定B-G的反应时间长,底物用量大,灵敏度亦低。
本试验中采用55℃作为反应温度,不仅缩短了反应时间,仅用2h即可,而且减少昂贵底物的用量,灵敏度提高3.1倍。
温度的升高使酶的活性升高是由于酶分子的某些基团在此温度下呈现一定的解离状态,有利于酶分子结构的稳定性。
也有学者认为,温度升高可将酶固定于细菌内部,产生固定化作用,使酶稳定性提高,减少了外界因素对酶活力的影响,从而提高酶活性。
正常情况下胆汁中也存在组织源性的B-G,但由于此时胆汁的pH值在中性偏碱范围内,故胆汁中B-G活性不高。
当胆汁被细菌感染后,细菌可将胆汁中结合胆酸分解为游离胆酸,因而游离胆酸浓度升高;同时,在有大量细菌存在、呈淤积状态的胆汁中,细菌的活动还可以分解胆汁中的蛋白质。
这两种因素促使胆汁pH值下降,正是细菌性B-G最适的pH值,B-G活性升高,促使C.B.转化为U.C.B.,后者与Ca2+结合形成牛黄。
程世模等研究发现,在pH<3.0环境下,B-G活性即遭破坏。
宋立新等证明,细菌性B-G在pH=4.5时其活性仅是pH =7.0时的20.66±1.27%。
阎家麒研究发现,天然胆红素牛黄胆囊胆汁和人工培植牛黄胆囊引流胆汁的B-G活性在pH=4.6和pH=7.0时释放的酚酞量均高于正常胆囊胆汁(p<0.01),其中pH=7.0时活性尤为显著。
Dever s证明,当pH值下降至7.0时,细菌性B-G活性最高,这与本试验得到的结果一致。