文献综述微生物气溶胶污染监测检测技术研究进展杜茜,李劲松＊(军事医学科学院微生物流行病研究所国家生物防护装备工程技术研究中心病原微生物生物安全国家重点实验室,北京100071))

摘要:微生物气溶胶对空气的污染问题越来越受到社会的关注。微生物气溶胶能引起人

类多种呼吸道疾病,因此,检测微生物气溶胶对于改善人们的生活环境具有重要意义。通过文献调研,对微生物气溶胶污染的现状做了简要介绍,概述了污染物气溶胶的多种监测检测方法,并对需要解决的难题及相关领域的研究进行了展望。 关键词:　微生物气溶胶;　检测与监测技术;　进展 中图分类号:X513 文献标志码:A 文章编号:1001-5248(2011)06-0455-04

气溶胶作为当前环境问题中的热点之一日益受到人们的关注〔1〕。虽然微生物气溶胶只是气溶胶中含量很少的组分,但由于它在许多气溶胶污染过程中起重要作用而越来越受到重视。微生物气溶胶是一群形体微小、构造简单的单细胞或接近单细胞的生物悬浮于空气中所成形的胶体体系,粒子大小在0.01～100μm,一般为0.1～30μm。微生物气溶胶具有6大特性:来源的多相性,种类的多样性,活性的易变性,播散的三维性,沉积的再生性,感染的广泛性〔2〕。微生物气溶胶的活性从它形成的瞬间开始就一直处于变化状态。空气中的微生物与人类生产和生活息息相关,它既可以造福人类,亦会危害人类的生活和健康。因此,研究与监测空气微生物气溶胶的浓度、种类、分布及其变化规律有重要意义〔3〕。目前,我国对空气微生物气溶胶的研究多为调查研究,即在一定时间内对某种场所进行空气微生物采样,了解微生物的浓度、种属等情况。室内空气微生物污染能引起各种呼吸道传染病、哮喘、建筑物综合征等多种疾病。室内空气污染微生物主要包括细菌、真菌(包括真菌孢子)、病毒、支原体、衣原体和基金项目:国家科技攻关计划资助项目(No.2008BAI62BO5)国家重点实验室课题(No.PBS2009C05)作者简介:杜茜(1977-),女,硕士研究生,北京军区总医院普通外科主管技师。从事生物安全及防护技术研究。＊通信作者E-mail:Lij-s@163.com其他微生物。在这些微生物污染因子中有一些细菌和病毒能够引起人类呼吸道传染病,有些真菌(包括真菌孢子)则能引起呼吸道过敏反应。病态建筑综合征(sickbuildingsyndrome,SBS)是近年国内外有关室内环境研究的热门话题。各种信息表明,空气微生物污染是造成这一综合征的主要原因之一。另外,大量使用空调也会发生空气微生物污染,污染源主要是空调系统的过滤器及风道、风口处的微生物,引起军团菌病、医院感染、过敏性疾病等。

1　微生物气溶胶污染检测方法 微生物气溶胶污染的检测方法很多,有传统的培养计数法、染色计数法、生物传感器技术、PCR法、基因芯片技术、环介导等温扩增核酸技术(Loop-Me-diatedIsothermalAmplification,LAMP)及质谱法等。1.1　培养计数法　培养计数法是传统的空气微生物气溶胶检测方法,一般用自然沉降或采样器把微生物采样到液体、固体或半固体的采样介质上,再经过培养繁殖生长成菌落后计数,然后进行分离和纯化,通过检测鉴定,确定为何种微生物。培养计数法只能检测经过培养能够繁殖的微生物,不能测定空气中不能培养和死亡的微生物〔4〕。传统培养计数法

只能在一定的条件下用于微生物的检测,难以反映真实的环境微生物状况,很大程度上限制了对实验结果的判定〔4〕。

·455·解放军预防医学杂志　2011年12月第29卷第6期　JPrevMedChinPLA　December2011　Vol.29No.61.2　染色计数法　DAPI(4,6-联脒-2-苯基吲哚)染色法已被认为是一种标准的测定浮游微生物总量的方法,而且操作简便,计数准确〔5〕。刘敬博等〔6〕采用DNA染色后直接镜检计数的方法来测定养殖环境内微生物气溶胶的浓度,得到较理想的结果。DAPI染色后的直接荧光镜检计数操作简单,不论是活细胞,还是死细胞、残核细胞都可以被检测出来,可得到一个客观真实的数据,是对某环境中微生物总量检测较为简捷、有效的方法〔7〕。1.3　生物传感器技术　生物传感器对生物物质敏感,并可将其浓度转换为电信号进行检测。生物传感器由固定化的生物敏感材料(包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质)作识别元件,与适当的理化换能器(如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等)及信号放大装置构成的分析工具或系统。生物传感器具有接受器与转换器的功能。军事医学中,对生物毒素的及时快速检测是防御生物武器的有效措施。2000年,美军报道已研制出可检测葡萄球菌肠毒素B、蓖麻素、土拉弗氏菌和肉毒杆菌等4种生物战剂的免疫传感器,检测时间为3～l0min,灵敏度分别为10mg/L,50mg/L,5×105cfu/ml和5×104cfu/ml。还有人制成了检测霍乱病毒的生物传感器,该生物传感器能在30min内检测出低于1×10-5mol/L的霍乱毒素,而且有较高的敏感性和选择性,操作简单。该方法能够用于具有多个信号识别位点的蛋白质毒素和病原体的检测。1.4　PCR方法　PCR方法特异性强,操作简便、快速,尤其是最新发展的定量PCR的方法,不仅灵敏度高,检测速度快,还可以实现对DNA或RNA的绝对定量分析,因此近几年在微生物气溶胶的研究中使用较多,有良好的应用前景。实时定量PCR(qPCR)方法能够快速且精确地检测微生物气溶胶。Hospodsky等〔8〕测定了qPCR在检测室内及其周围环境中气溶胶样品时的准确度、精密度及检测极限。Keswani等〔9〕采用传统方法和实时定量PCR法对室内环境中的尘埃样本进行了快速检测,结果表明,简单的样本处理方法与PCR法相结合对于监测室内环境中真菌气溶胶的含量具有潜在作用。Fallschissel等〔10〕用实时定量PCR检测和量化禽舍空气中沙门氏菌属细胞浓度,结果表明,经过滤的沙门氏菌属细胞在过滤20min内死亡率为82%。说明实时定量PCR对于检测和分析沙门氏菌属气溶胶具有特异性和可行性。Pyankov等〔11〕开发出一种新的采样器,且用实验证实了这种采样器用于检测空气微生物(包括细菌、真菌及病毒)的可行性。采用实时PCR与采样器相结合的方法检测空气中病毒,这种方法的优点是,如果空气中有特殊病原体存在且能够被PCR方法检测,剩余液体可以用来进一步分析空气中微生物的感染力。这种采样器与PCR方法相结合的检测方法快速且精确度高,用于鉴定易变化的空气中的病毒是完全可行的。结核病仍是许多发达国家的卫生问题。Vadrot等〔12〕用PCR方法检测医院空气样本中的结核分枝杆菌,结果表明,该方法对医院诊断肺结核初期患者有积极效果。Yuan等〔13〕为了解猪舍中微生物气溶胶的传播,以埃希氏大肠杆菌作为指标,采用ERIC-PCR技术,分离扩增大肠杆菌DNA样本,然后将扩增结果用NTSYS-PC机(2.10版本)分析,以确定是否为相似性大肠杆菌。得出如下结论:猪舍的气溶胶可能扩散到周围的环境,因此应采取有效措施控制以减少微生物气溶胶的传播。1.5　基因芯片技术　基因芯片(又称DNA芯片、生物芯片)技术指将大量(通常每平方厘米点阵密度高于400)探针分子固定于支持物上后,与标记的样品分子进行杂交,通过检测每个探针分子的杂交信号强度,进而获取样品分子的数量和序列信息。Lin等〔14〕建立一种oligo基因芯片,可检测9种呼吸道病毒(包括流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、冠状病毒、副流感病毒等)。靳连群等〔15〕应用基因芯片技术对涉及9个菌属的143株肠道致病菌及相关细菌,在相同的条件下,进行杂交检测,得到菌属(种)特异性杂交图谱,根据不同菌属的细菌所呈现的特征性的杂交图谱,可以区分沙门氏菌属、志贺氏菌属、埃希氏菌属、葡萄球菌属、变形杆菌属的细菌,以及小肠结肠炎耶尔森氏菌、副溶血性弧菌等。Stratis-Cullum等〔16〕使用枯草芽孢杆菌代替炭疽芽孢杆菌分析论证了一种新的检测生物战剂的系统。在一个灵敏且有选择性的酶联免疫吸附试验中,使用一种新的荧光底物碱性磷酸酶与生物芯片相结合的检测系统,该系统包括一个激发的微型二极管激光器、便携式微生物气溶胶采样器。与微型生物芯片系统结合可检测出100个枯草芽孢杆菌孢子,相当于空气中气溶胶孢子浓度17个/L。此外,还包括检测时间和灵敏度的研究。2000年,Notomi等〔17〕开发的一种新颖的核酸扩增方法—环介导等温扩增核酸技术(Loop-MediatedIsothermalAmplification,LAMP),与其他检测方法相比,该方法具有特异性强、灵敏度高、扩增高效快速、步骤简单、鉴定简便等

·456·解放军预防医学杂志　2011年12月第29卷第6期　JPrevMedChinPLA　December2011　Vol.29No.6优点。该方法可以在1h以内于恒温条件下特异地扩增DNA到109个拷贝。如果将LAMP技术与空气微生物检测技术相结合,有望成为简易的空气微生物快速检测手段。1.6　质谱法　生物气溶胶质谱仪是一种实时的单细胞分析技术,Tobias等〔18〕用其跟踪测量一群萎缩芽孢杆菌的孢子形成过程中单个细胞的生化和形态的改变。Russell等〔19〕应用生物气溶胶质谱仪对单细胞进行实时分析,为提高生物气溶胶质谱仪的质量范围和灵敏度,开发了一个新的设计:利用一个具有定时提取和静电离子指导的线性飞行管。此研究提高了生物气溶胶质谱仪的检测灵敏度,并评估了其用于检测单细胞生物指标的可行性。该分析包括计算每个粒子的粒径、密度和溶液的摩尔浓度。To-bias等〔20〕在单粒子激光电离时间飞行质谱法中,以生物气溶胶质谱仪的形式检测结核分枝杆菌H37Ra粒子,被称为包含一个单细胞或少数聚合细胞的快速探测器。这对于设计开发肺结核粒子检测器直接检测传染病患者产生的肺结核气溶胶迈出了第一步。在国内,气溶胶质谱仪仅在化学和空气污染的研究中得到应用。张雅萍等〔21〕使用气溶胶飞行时间质谱仪(ATOFMS)对2007年8月(夏季)和2008年2～3月(冬季)上海大气中含重金属Zn、Cu的颗粒物进行了分析,结果表明,冬季的重金属污染比夏季严重,在单位时间内冬季观测到的含铜颗粒物数目是夏季的2倍,夏季没有观测到含锌颗粒物,而冬季观测到大量的含锌颗粒物。王振亚等〔22〕还采用实时测量气溶胶粒子直径和化学成分的气溶胶飞行时间质谱仪,测量了二次有机气溶胶粒子的直径分布和分子成分。以上所列举的方法有些是微生物的检测技术,这些检测技术都可以应用于微生物气溶胶的检测中,但有的需要样品处理,如纯培养,而针对气溶胶独特设计的检测仪器则可以直接出结果,无需后续的实验室处理。2　微生物气溶胶污染监测方法 在进行微生物气溶胶污染检测的同时,对微生物气溶胶污染的实时监测也很重要。戴金平等〔23〕对医院普通手术室微生物气溶胶污染进行了监测。普通手术室微生物气溶胶污染严重,应采用能在有人活动的场合持续除菌和杀菌、动态控制微生物气溶胶浓度、达到医院空气消毒卫生标准的空气消毒方法。马瑞华等〔24〕采用Andersen6级撞击式空气样品采样器及选择性培养基麦康凯监测神经科病房内的肠杆菌气溶胶含量,对控制医院获得性呼吸系统感染有重要意义。于淼等〔25〕对自由表面流人工湿地3-9月细菌、真菌气溶胶数量和粒径分布进行监测,以确定人工湿地微生物气溶胶数量和粒径分布特征。结果表明,存在于大气中的微生物除受采样区域人为活动、土壤状况、污水水质和植被影响外,还受大气温度、湿度、紫外线、风速和风向等气象参数的影响。生物传感器已应用于监测多种细菌、病毒及其毒素,如炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、埃博拉出血热病毒、肉毒杆菌类毒素等。Zeng等〔26〕