植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (5): 659−666, www.chinbullbotany.com

收稿日期: 2006-10-24; 接受日期: 2007-04-09基金项目: 973重大基础研究前期研究专项(No. 2005CCA02400)* 通讯作者。E-mail: khpan@ouc.edu.cn缩写词: AA: arachidonic acid; ALA: α-linolenic acid; DGLA: dihomo-γ-linolenic acid; DHA: docosapentaenoic acid; EDA: eicosadienoicacid; EPA: eicosapentaenoic acid; ER: endoplasmic reticulum; ETA: eicosatetraenoic acid; GLA: γ-linolenic acid; LA: linoleic acid;LPCAT: lyso-phosphatidycholine acyltransferase; OA: oleic acid; PC: phosphatidycholine; PDAT: phospholipid diacylglycerolacyltransferase; PUFAs: polyunsaturated fatty acids; SDA: stearidonic acid; TAG: triacylglycerol; TPA: tetracosapentaenoic acid;VLCPUFAs: very long-chain polyunsaturated fatty acids.专题介绍.

转基因植物生产超长链多不饱和脂肪酸研究进展

石娟, 朱葆华, 潘克厚*

中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室, 青岛 266003

摘要 超长链多不饱和脂肪酸(VLCPUFAs)对人类健康非常重要。日常摄入一定量的VLCPUFAs能够补充人体自身合成的不足, 并对某些疾病起到明显的预防和治疗作用。VLCPUFAs主要源自深海鱼油, 但由于市场需求的迅速增长和海洋可捕捞鱼类资源的日益减少, 该途径已经远远不能满足市场的需要, 寻找更为持续且稳定的VLCPUFAs来源已经成为当务之急。最近, 人们已经克隆了VLCPUFAs生物合成相关的去饱和酶和延伸酶基因, 并希望在植物特别是油料作物中共表达这些基因, 使其成为生产VLCPUFAs的“绿色细胞工厂”。目前已有多个研究小组在进行转基因植物合成VLCPUFAs的探索, 并取得了突破性的研究成果。本文综述了相关的研究进展, 并对存在的问题和解决策略进行了探讨。

关键词 DHA, EPA, 转基因植物, 超长链多不饱和脂肪酸

石娟, 朱葆华, 潘克厚 (2007). 转基因植物生产超长链多不饱和脂肪酸研究进展. 植物学通报 24, 659−666.

超长链多不饱和脂肪酸(VLCPUFAs)是指含有20或22个碳原子及4－6个亚甲基间隔的顺式双键的脂肪

酸链(Abbadi et al., 2004), 包括花生四烯酸(AA, 20:4n6)、二十碳五烯酸(EPA, 20:5n3)和二十二碳六烯酸(DHA, 22:6n3)。多不饱和脂肪酸(PUFAs)可分为n6系

列和n3系列。AA属于n6 PUFAs; EPA和DHA属于n3 PUFAs。研究表明, VLCPUFAs对人类健康非常重

要。AA和EPA是哺乳动物细胞膜的组分, 也是生成前列腺素、白三烯和血栓素等激素的前体(Funk, 2001)。EPA在凝血、免疫和抗炎症等各种生理反应中起重要

作用(Simopoulos, 2002)。DHA对胎儿神经系统的形成至关重要(Uauy et al., 2001), 还影响着视网膜视紫

红质的活性(Giusto et al., 2000), 并与某些疾病如关节

炎、动脉硬化、抑郁症的预防和治疗有关(Horrocksand Yeo, 1999; Marszalek and Lodish, 2005)。

人体合成EPA和DHA的效率极低, 在日常饮食中补充足够的EPA和DHA对维持身体健康极为重要。目前该类脂肪酸的主要来源是深海鱼油, 但是鱼类自身并

不能合成VLCPUFAs, 而是通过摄食富含VLCPUFAs

的海藻等进行有限的积累; 另外, 过度捕捞使海洋鱼类资源日益减少, 该途径已经远远不能满足迅速增加的市场

需求。此外, 由于环境污染等原因导致鱼油中的重金属

含量越来越高, 寻找更为持续、稳定、安全的EPA和DHA来源成为当务之急(Tonon et al., 2002; Domergueet al., 2005a)。已知某些微生物如真菌和海洋微藻能

够从头合成VLCPUFAs且含量丰富(Sayanova andNapier, 2004); 然而现已开发出的商业化的海藻油和真菌油, 由于其产量低和提取成本高限制了这类资源的大

规模应用。鉴于植物油的提取工艺非常成熟, 许多研究

者已经将目光转向油料作物的代谢工程, 探索如何利用转基因植物作为“绿色细胞工厂”生产VLCPUFAs(Truksa et al., 2006)。近年来国外一些研究小组已在660植物学通报 24(5) 2007

该领域取得了突破性的成果, 表明转基因植物的确有望

成为稳定且廉价的EPA和DHA来源。本文介绍了相关的研究进展, 并对存在的问题和解决策略进行了探

讨。迄今为止, 国内这方面的研究报道较少, 而我国作

为世界上人口最多的国家, 今后必将成为VLCPUFAs的消费大国; 因此, 转基因油料作物的开发将会具有非常广

阔的市场前景, 希望本文能为相关的研究人员提供有价

值的参考。

1 VLCPUFAs合成通路及相关的酶

绝大多数生物是从油酸(OA, 18:1n9)开始合成多不饱和

脂肪酸的, 该过程涉及一系列去饱和及延伸反应。某些

真菌和海洋微藻具有合成VLCPUFAs的所有去饱和酶和延伸酶, 能够从头合成VLCPUFAs。其合成途径主

要为经典的n6和n3途径, 即由OA生成的亚油酸(LA,18:2n6）和α-亚麻酸(ALA, 18:3n3)在∆6去饱和酶作用下生成γ-亚麻酸(GLA, 18:3n6)和十八碳四烯酸(SDA,18:4n3), 然后经∆6延伸和∆5去饱和生成AA和EPA,

EPA又可经∆5延伸和∆4去饱和生成DHA(图1A)。在

这个过程中, n6脂肪酸可在∆15和∆17去饱和酶(这类去饱和酶又称为ω3去饱和酶)作用下生成n3脂肪酸。在

某些微藻如等鞭金藻中, C20-VLCPUFAs的合成还存在

一条“替代通路”, 即LA先经∆9延伸酶延伸生成二十碳二烯酸(EDA, 20:2n6), 然后在∆8去饱和酶作用下生

成二均-γ-亚麻酸(DGLA, 20:3n6), 进而∆5去饱和为AA(图1A)。哺乳动物体内缺乏∆12(ω6)和∆15(ω3)去饱和酶, 不能生成LA和ALA, 必须从食物中补充; 哺乳动物

可将外源LA和ALA经n6和n3途径转化为AA和EPA。

其DHA的合成较为复杂, 首先EPA通过2次连续的延伸反应生成二十四碳五烯酸(TPA, 24:5n3), 然后经∆6

去饱和及一轮发生于过氧化物酶体的β-氧化生成DHA(Qiu, 2003) (图1A)。高等植物(包括油料作物)一般只能合成油酸和亚油酸, 不能继续合成长链的多不饱和脂

肪酸; 要想在植物中合成VLCPUFAs, 必须转入相关的

去饱和酶和延伸酶基因。关于不同生物合成VLCPUFAs的详细描述参见文献(Napier et al., 2003;Sperling et al., 2003; Sayanova and Napier, 2004)。

VLCPUFAs合成过程中涉及的去饱和酶和延伸酶基因均已被克隆鉴定, 研究表明这些酶都位于细胞内质

网(ER)膜上(Huang et al., 2004)。不同来源的去饱和

酶其作用底物有所不同, 动物中的去饱和酶以酰基-CoA中的脂肪酸为底物, 植物和微生物中的去饱和酶则以磷

脂特别是磷脂酰胆碱(PC)中的脂肪酸为底物(Los andMurata, 1998)。目前发现的长链脂肪酸延伸酶均以酰基-CoA中的脂肪酸为底物, 该类脂肪酸是由4个酶组成

的延伸复合体, 催化包括缩合、酮酰还原、脱水及烯

酰还原等一系列反应, 其中缩合酶(即延伸酶)决定着底物专一性(Leonard et al., 2004)。由于植物和微生物中

的去饱和酶和延伸酶作用底物不同, 其VLCPUFAs的合

成比较复杂, 涉及脂肪酸在酰基-CoA库和PC库间的转移; 相关的酰基转移酶(LPCAT)也起着非常重要的作用(Domergue et al., 2003)。

2 转基因植物中VLCPUFAs的合成

2.1 “替代通路”的构建和C20-VLCPUFAs的生成

Qi等(2004)将等鞭金藻的C18∆9延伸酶、眼虫的∆8去

饱和酶和高山被孢霉的∆5去饱和酶基因转入模式植物拟南芥中, 构建了合成VLCPUFAs的“替代通路”, 成

功实现了C20-VLCPUFAs的合成。他们(Qi et al.,2004)之所以没有构建经典途径是因为拟南芥酰基-CoA库中LA-CoA和ALA-CoA含量较高, 可以被C18∆9延

伸酶直接利用, 减少了脂肪酸在PC库和CoA库之间的

转移,有利于VLCPUFAs合成的起始。转基因拟南芥叶片的脂质分析结果显示, 新生成的C20-VLCPUFAs

占总脂肪酸的18.8%, 其中AA和EPA的含量分别为6.6%和3.0%(表1)。除此之外还检测到了一些由∆5去饱和酶催化生成的副产物, 包括20:3∆5,11,12和20:4∆5,11,14,17, 说明转入的∆5去饱和酶的底物专一性不

强。虽然有研究表明, 这些脂肪酸可能对人体有益(Nakane et al., 2000), 但是其具体作用并不明确。尽

管如此, 该小组在本领域取得了突破性成果, 首次证明了

高等植物通过转基因合成VLCPUFAs是可行的。661石娟等: 转基因植物生产超长链多不饱和脂肪酸研究进展

2.2 经典通路的构建和C20-VLCPUFAs的生成

上述研究仅在拟南芥叶片中实现了C20-VLCPUFAs的

合成,考虑到脂肪酸必须被转化为三酰甘油(TAG)才能被有效存贮和利用, Abbadi等(2004)进行了转基因植物种

子合成C20-VLCPUFAs的探索。

他们以烟草和亚麻作为目标植物, 所转基因均由种子特异的启动子控制, 包括小立碗藓、琉璃苣和三角褐

指藻的∆6去饱和酶基因, 小立碗藓和线虫的C18∆6延

伸酶以及高山被孢霉和三角褐指藻的∆5去饱和酶基因,通过这些基因的不同组合, 构建了经典的n6和n3途径(Abbadi et al., 2004)。结果只有1种组合在亚麻中成

功实现了C20-VLCPUFAs的生成(表1)。脂质分析表明, GLA和SDA能够在亚麻种子中大量积累(>25%), 但AA和EPA含量极低, 分别为1.0%和0.8%(表1)。由于DGLA和ETA的含量也非常低, 分别为1.2%和0.9%,

所以推断C18∆6延伸一步为整个合成通路的“瓶颈”。

为此作者又进行了一系列实验来寻找延伸效率低的原因:RT-PCR及体外酶活分析显示, 发育种子中∆6延伸酶基

因转录活跃, 所表达的蛋白具有很高的延伸酶活性; 而对

发育种子酰基-CoA库的分析显示, ∆6延伸酶的适宜底物GLA-CoA和SDA-CoA含量很少。因此, 作者推测

不是延伸酶的催化活性而是底物的适用性限制了C18的

延伸效率。如前所述, 植物中去饱和酶的底物为PC库中的脂肪酸, 而延伸酶的底物为酰基-CoA库中的脂肪

酸, 如果∆6去饱和产物不能有效的从PC库转入酰基-CoA库, 就不能被延伸酶所催化。作者分析影响脂肪酸进入酰基-CoA库的可能原因主要有两点: 一是负责脂肪

酸在PC库和酰基-CoA库之间转移的LPCAT不能有效

识别并转移非植物自身的脂肪酸; 二是由于SDA可经不表1 不同转基因植物中VLCPUFAs的生成Table 1 The synthesis of VLCPUFAs in different transgenic plantsHost plantHeterologous enzymesAA(%)EPA(%)DHA(%) ReferenceArabidopsis leavesIg∆9Elo+Eg∆8Des+Ma∆5Des6.63.00.0Qi et al., 2004Linseed seedsPt∆6Des+Pp∆6Elo+Pt∆5Des1.00.80.0Abbadi et al., 2004Soybean seedsSd∆6Des+Ma∆6Elo+Ma∆5Des and2.219.60.0Kinney et al., 2004At∆15Des+Sd∆17DesSoybean somaticSd∆6Des+Ma∆6Elo+Ma∆5Des and5.26.13.1Knney et al., 2004embryosPav∆5Elo+Sa∆4Des+Sd∆17DesArabidopsis seedsDr∆6/∆5Des+Ce∆6Elo+Ma∆5Des1.22.50.5Robert et al., 2005Brassica juncea seedsPi∆6Des+Tc∆5Des+Pp∆6Elo7.30.80.0Wu et al., 2005Pi∆6Des+Tc∆5Des+Pp∆6Elo+Co∆12Des12.01.30.0Pi∆6Des+Tc∆5Des+Pp∆6Elo+Co∆12Des+Tc∆6Elo13.71.40.0Pi∆6Des+Tc∆5Des+Pp∆6Elo+Co∆12Des+Tc∆6Elo+Pinω3Des5.48.10.0Pi∆6Des+Tc∆5Des+Pp∆6Elo+Co∆12Des+Tc∆6Elo+Pinω3Des and4.08.10.2Tc∆4Des+TcAT+Om∆5EloVLCPUFA: 超长链多不饱和脂肪酸; AA: 花生四烯酸; EPA: 二十碳五烯酸; DHA: 二十二碳六烯酸; Des: 去饱和酶; Elo: 延伸酶; At: 拟南芥; Ce: 秀丽线虫; Co: 金盏菊; Dr: 斑马鱼; Eg: 纤细裸藻; Ig: 球等鞭金藻; Ma: 高山被孢霉; Om: 虹鳟; Pav: 巴夫藻; Pi: 拉曼被孢霉; Pin:一种霉菌; Pp: 小立碗藓; Ps: 盐生巴夫藻; Pt: 三角褐指藻; Sa: 裂殖壶菌; Sd: 异枝水霉; Th: 一种海洋真菌VLCPUFA: very-long-chain polyunsaturated fatty acid; AA: arachidonic acid; EPA: eicosapentaenoic acid; DHA: docosahexaenoicacid; Des: desaturases; Elo: elongase; At: Arabidopsis thaliana; Ce: Caenorhabditis elegans; Co: Calendula officinalis; Dr: Daniorerio; Eg: Euglena gracilis; Ig: Isochrysis galbana; Ma: Mortierella alpina; Om: Onchorhynchus mykiss; Pav: Pavlova sp.; Pi:Pythium irregulare; Pin: Phythophtora infestans; Pp: Physcomitrella patens; Ps: Pavlova salina; Pt: Phaeodactylum tricornutum;Sa: Schizochytrium aggregatum; Sd: Saprolegnia diclina; Th: Thraustochytrium

sp.