【通讯作者】吴峥峥ＤＨＡ与ＥＰＡ合成超长链多不饱和脂肪酸的效率比较余　曼，陈　波，张瑞帆，吴峥峥（四川省医学科学院・四川省人民医院眼科，四川成都６１００７２）

【摘要】　目的　比较在ＥＬＯＶＬ４蛋白酶催化作用下，ＤＨＡ和ＥＰＡ合成超长链多不饱和脂肪酸ＶＬＣ－ＰＵＦＡ的效率。方法　构建携带ＥＬＯＶＬ４基因和绿色荧光蛋白的重组腺病毒，转入培养的ＰＣ１２细胞，通过ｑＲＴ－ＰＣＲ定量分析ＥＬＯＶＬ４基因的表达量，ＷＢ检测ＥＬＯＶＬ４蛋白的表达；１∶１加入ＤＨＡ和ＥＰＡ，孵育４８ｈ之后进行脂肪酸提取，通过气相质谱ＧＣ－ＭＳ分析超长链脂肪酸的成分。结果　ＧＣ－ＭＳ检测到分别用ＤＨＡ及ＥＰＡ处理后的ＰＣ１２＋Ａｄ－ＥＬＯＶＬ４的细胞中有ｎ３ＶＬＣ－ＰＵＦＡ的表达，３４：５ｎ３和３６：５ｎ３分别为０畅８５％和１畅１１％；３４：６ｎ３和３６：６ｎ３分别为０畅１６％和０畅２９％；ＥＰＡ所产生的五烯酸总和是ＤＨＡ所产生的六烯酸总和的４倍。结论　ＥＰＡ合成ＶＬＣ－ＰＵＦＡ的效率远远高于ＤＨＡ，为患者提供更高比例的ＥＰＡ，而非ＤＨＡ，可能是治疗ＳＴＧＤ３疾病的方式之一。【关键词】　二十二碳六烯酸；二十碳五烯酸；ＥＬＯＶＬ４基因；Ｓｔａｒｇａｒｄｔ病；超长链多不和脂肪酸【中图分类号】Ｒ７７ 【文献标志码】Ａ 【文章编号】１６７２－６１７０（２０１４）０５－００２４－０４

ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｂｅｔｗｅｅｎＤＨＡａｎｄＥＰＡｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｖｅｒｙｌｏｎｇｃｈａｉｎｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓ　ＹＵＭａｎ，ＣＨＥＮＢｏ，ＺＨＡＮＧＲｕｉ－ｆａｎ，ＷＵＺｈｅｎｇ－ｚｈｅｎｇ　（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｐｈ－

ｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，ＳｉｃｈｕａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ＆ＳｉｃｈｕａｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＰｅｏｐｌｅ摧ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００７２，Ｃｈｉｎａ）

【Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ】　ＷＵＺｈｅｎｇ－ｚｈｅｎｇ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｂｅｔｗｅｅｎＤＨＡａｎｄＥＰＡｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｖｅｒｙｌｏｎｇｃｈａｉｎｐｏｌｙｕｎｓａｔ－ｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄ（ＶＬＣ－ＰＵＦＡｓ）ｕｎｄｅｒｃａｔａｌｙｔｉｃａｃｔｉｏｎｏｆＥＬＯＶＬ４ｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＰＣ１２ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｄｕｃｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｔｙｐｅ５ｃａｒｒｙｉｎｇｍｏｕｓｅＥｌｏｖｌ４ａｎｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）．ＧＦＰ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｎｄｎｏｎ－ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄｃｅｌｌｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｃｏｎｔｒｏｌｓ．ＥＬＯＶＬ４ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｑｕａｎｔｉｆｉｅｄｂｙｑＲＴ－ＰＣＲｓ．ＥＬＯＶＬ４ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ（ＷＢ）．ＴｈｅｔｒａｎｓｄｕｃｅｄｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＤＨＡｏｒＥＰＡ（１：１）．Ａｆｔｅｒ４８ｈｏｆｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ，ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄ，ａｎｄｆａｔｔｙａｃｉｄｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒｓｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄｆｏｌｌｏｗｉｎｇｔｏｔａｌｌｉｐｉｄｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｆａｔｔｙａｃｉｄｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｕｓｉｎｇａｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＧＣ－ＭＳ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＧＣ－ＭＳａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＤＨＡａｎｄＥＰＡｔｒｅａｔｅｄＰＣ１２＋Ａｄ－ＥＬＯＶＬ４ｈａｄｎ３ＶＬＣ－ＰＵＦＡｓｉｎｗｈｉｃｈ３４：５ｎ３ａｎｄ３６：５ｎ３ｗｅｒｅ０畅８５％ａｎｄ１畅１１％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；３４：６ｎ３ａｎｄ３６：６ｎ３ｗｅｒｅ０畅１６％ａｎｄ０畅２９％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｏｔａｌａｍｏｕｎｔｏｆｐｅｎｔａｅｎｏｉｃｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｆｒｏｍＥＰＡｗａｓａｌｍｏｓｔｆｏｕｒｔｉｍｅｓｔｈａｎｔｈａｔｏｆｈｅｘａｅｎｏｉｃｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｆｒｏｍＤＨＡ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＥｌｏｎｇａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＶＬＣ－ＰＵＦＡｓｆｒｏｍＥＰＡｉｓｍｕｃｈｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｆｒｏｍＤＨＡ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｄｉｅｔａｒｙｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｍｏｒｅＥＰＡｒａｔｈｅｒｔｈａｎＤＨＡｍａｙｐｒｏｖｉｄｅｓｏｍｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｂｅｎｅｆｉｔｓｆｏｒｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＳｔａｒｇａｒｄｔｓ摧ｄｉｓｅａｓｅ（ＳＴＧＤ３）．

【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】　Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃａｃｉｄ（ＤＨＡ），Ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃａｃｉｄ（ＥＰＡ），ＥＬＯＶＬ４ｇｅｎｅ，Ｓｔａｒｇａｒｄｔｓ摧ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｅｒｙｌｏｎｇｃｈａｉｎｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄ（ＶＬＣ－ＰＵＦＡ）

以ＤＨＡ和ＥＰＡ为代表的ｎ３ＰＵＦＡｓ（ｐｏｌｙｕｎｓａｔ－ｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓ，ＰＵＦＡｓ）是指含有两个或两个以上双键的一类脂肪酸，通常按照第一个双键的位置把多不饱和脂肪酸分类，其中ｎ３ＰＵＦＡｓ，即从甲基端数第１个双键的位置在第３碳位的多不饱和脂肪酸，如二十二碳六烯酸（２２：６ｎ３，ＤＨＡ）和二十碳五烯酸（２０：５ｎ３，ＥＰＡ）。在哺乳动物神经系统中，ｎ３ＰＵＦＡｓ不但是重要的结构组分，而且是重要的营养因子［１］。ＤＨＡ被认为是功能最强的ｎ３ＰＵＦＡｓ，ＤＨＡ与人类多种神经性疾病，例如阿尔默茨症［２］。Ｓｔａｒｇａｒｄｔ病（Ｓｔａｒｇａｒｄｔ－ｌｉｋｅｍａｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ＳＴＧＤ）是一种发生于青少年期的遗传性黄斑营养不良，目前尚无有效的治疗方法。近年来的研究又发现，ＥＬＯＶＬ４基因第ＶＩ外显子上突变导致了人类的常染色体显性遗传ＳＴＧＤ３的发病［３］。ＥＬＯＶＬ４属于超长链脂肪酸延伸酶（ｅｌｏｎｇａｓｅｏｆＥＬＯｎｇａｔｉｏｎｏｆｖｅｒｙｌｏｎｇｃｈａｉｎｆａｔｔｙａｃｉｄｓ，ＥＬＯＶＬ）家族，已被证实参

与多不饱和脂肪酸（ｖｅｒｙｌｏｎｇｃｈａｉｎＰＵＦＡ，ＶＬＣ－ＰＵ－ＦＡ）的Ｃ２８－Ｃ３８碳链延长的生化过程［４］。ＭｃＭａｈｏｎ

等发现，ＥＬＯＶＬ４基因突变的ＳＴＧＤ３小鼠模型的视网膜中的Ｃ３２－Ｃ３６酰基磷脂酰胆碱的水平下降［５］，

ＶＬＣ－ＰＵＦＡ水平减少还会导师ＥＲＧ波幅的下降，因

此，治疗ＳＴＧＤ３的策略之一可能是通过食物供给方式将ＶＬＣ－ＰＵＦＡ送到视网膜组织。然而，由于ＶＬＣ－ＰＵＦＡ结构的不稳定性，使得其很能被大量生产，那

么另外一种方式就是通过提供ＶＬＣ－ＰＵＦＡ的前体物质，体内合成ＶＬＣ－ＰＵＦＡ。图１显示ｎ３ＰＵＦＡｓ的合成通路，我们看到ＤＨＡ和ＥＰＡ均为ＶＬＣ－ＰＵＦＡ的前体脂肪酸，尤其是ＤＨＡ占有在感光体外部节段磷脂中大约５０％的脂肪酸［６］，它在神经系统以及视网

膜中的作用曾受到广泛的关注。本研究将转基因ＥＬＯＶＬ４蛋白在ＰＣ１２细胞中过量表达，等浓度加入

４２　实用医院临床杂志２０１４年９月第１１卷第５期　ＤＨＡ和ＥＰＡ，通过气相质谱（ｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＧＣ－ＭＳ）定量分析ＤＨＡ和ＥＰＡ的转化效率。图１　ＥＬＯＶＬ４蛋白酶催化Ｃ２８－Ｃ３８ＰＵＦＡ的合成。１　材料与方法１畅１　重组腺病毒载体的构建、细胞培养和病毒转导携带鼠ＥＬＯＶＬ４基因和绿色荧光蛋白（ＧＦＰ作为对照）的重组腺病毒构建系统采用ＡｄｅｎｏＸ腺病毒表达系统２和Ｃｒｅａｔｏｒ技术［４］。将重组病毒质粒转染ＨＥＫ２９３细胞，在转染３６小时后开始收集、纯化培养液中的病毒。流式细胞仪测定滴度。ＰＣ１２细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株由我院人类分子生物学与遗传研究中心实验动物中心引入，培养于含体积分数为１０％马血清、体积分数５％胎牛血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养基中，体积分数５％ＣＯ２条件下培养。次日，进行病毒转导，即将Ａｄ－ＧＦＰ和Ａｄ－ＥＬＯＶＬ４病毒质粒按１×１０４至２×１０４ｐｆｕ／ｍｌ浓度滴度加入含有２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ的细胞培养液中。转导２４时后，观察并纪录ＧＦＰ表达情况和细胞形态变化，ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测ＥＬＯＶＬ４和ＧＦＰ的蛋白表达量。１畅２　ＲＴ－ＰＣＲ　采用ＰｕｒｅＬｉｎｋＭｉｃｒｏｔｏＭｉｄｉ总ＲＮＡ提取试剂盒（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ），提取ＰＣ１２、ＰＣ１２＋Ａｄ－ＧＦＰ和ＰＣ１２＋Ａｄ－ＥＬＯＶＬ４三组细胞的ＲＮＡ。构建２５μｌ反应体系，上样扩增。琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相，扫描各条带灰度值，定量分析，ＲＰＬ１９为管家基因。１畅３　供给ＤＨＡ和ＥＰＡ于ＰＣ１２细胞　制备牛血清白蛋白ＢＳＡ共轭ＥＰＡ和ＤＨＡ：纯度高于９９％的ＥＰＡ的钠盐购自Ｎｕ－ＣｈｅｋＰｒｅｐ，Ｉｎｃ．（Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）；纯度高于９５％的ＤＨＡ的钠盐购自ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）。每种钠盐溶于ＢＳＡ，制备成ＢＳＡ共轭ＤＨＡ和ＥＰＡ制备，储存于－８０℃备用。当外源基因ＥＬＯＶＬ４在ＰＣ１２细胞中转染成功，细胞培养２４小时后，培养被替换为含有ＤＨＡ和ＥＰＡ（１∶１）的培养液，两种ＰＵＦＡ的浓度控制在１５～２０μｇ／ｍｌ，以防浓度过高导致的细胞死亡。在孵育４８之后，用含有５０μｍＢＳＡ的ＰＢＳ溶液的清洗细胞一次，然后用不含ＢＳＡ的ＰＢＳ溶液清洗细胞两次，收集细胞，储存于－８０℃备用。１畅４　脂肪酸提取和薄层色谱（ｔｈｉｎｌａｙｅｒｃｈｒｏｍａ－

ｔｏｇｒａｐｈｙ，ＴＬＣ）　从至少２ｍｇ的细胞蛋白中提取

总脂质，参照Ｂｌｉｇｈ－Ｄｙｅｒ法提取总脂质［４］，将含有脂

质的氯仿溶液储存在－２０℃中备用。加入５０ｎｍ的１５：０，１７：０，２３：０（短链脂肪酸的参照物）和４ｎｍ的３０：３ｎ６（作为长链脂肪酸的参照物）。之后，在加入１６畅６％的ＨＣｌ的甲醇溶液，在氮气下封好装有氯仿的试管口后，１００℃加热过夜，第二天将试管在冰上冷却。将上述获得的溶液用毛细管在硅胶层析板上，分离脂质［７］。分离的脂质是无色的，用二氯荧

光黄使其显色，之后将脂质从层析板上刮除，分类收集到试管中，从而得到脂肪酸甲酯（ｆａｔｔｙａｃｉｄｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ，ＦＡＭＥ），置入色谱质谱仪上分析。

１畅５　ＧＣ－ＭＳ　分析脂肪酸ＦＡＭＥ定量分析：采用ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ６８９０Ｎ气相色谱和火焰离子检