浙江临床医学2019年6月第21卷第6期·750··论著·

【摘要】 目的 研究医院耐碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌的耐药机制和分子同源性，为医院感染的预防和控制提供可靠的研究基

础。方法 收集临床分离的碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌；琼脂稀释法测定抗生素最低抑菌浓度（MIC）；PCR特异扩增和序列比对分析研究细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的分子机制及流行特征。结果 分离碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌共189株，均为产blaKPC-2

肺炎克雷伯菌，其对美罗培南、亚胺培南和厄他培南的MIC范围分别为2~128mg/L、4~128mg/L、4~128mg/L。其中5株细菌同时产blaVIM-1。

ERIC分型显示189株细菌分为a型、b型，其中a型较多（67.9%）。结论 院内可能有过携带blaKPC-2的肺炎克雷伯菌引起的医院内暴发流行，需要加强消毒隔离，防止进一步播散。【关键词】 肺炎克雷伯菌 碳青霉烯 KPC-2 

【Abstract】 Objective To investigate the mechanism of reduced susceptibility to carbapenems of Klebsiella pneumoniae and its homology. 

Methods The clinical isolates of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae were collected，The minimum inhibitory concentration（MIC）

of antibiotics was determined by agar dilution method. The molecular mechanism and epidemiological characteristics of carbapenem-resistant bacteria were analyzed by PCR-specific amplification and sequence alignment. Results A total of 64 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains were isolated. All of them were BlaKPC-2-producing Klebsiella pneumoniae. The MIC ranges of meropenem，imipenem and ertapenem were 2~128mg/L，4~128mg/L，4~128mg/L，respectively. 2 strains of bacteria produce blaVIM-1 simultaneously. ERIC typing showed that 64 strains of bacteria were classified into type A and B，among which type A was more（67.9%）. Conclusion Hospital outbreaks caused by Klebsiella pneumoniae carrying blaKPC-2 may have occurred in hospitals，and disinfection and isolation should be strengthened to prevent further dissemination【Key words】 Klebsiella pneumoniae Carbapenem KPC-2

碳青霉烯类抗生素因其抗菌谱广、抗菌活性强、对ESBLs稳定及毒性低等优点，一直作为ESBLs菌株严重感染患者的首要选择，曾被称为临床治疗阴性菌所致严重感染的“最后一道防线”［1］。但近些年随着碳青霉烯类抗生素在临床的广泛使用，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的报道越来越多［2］。其中KPC型碳青霉烯酶于2001年美国首先报道在肺炎克雷伯菌中发现的一种丝氨酸酶［3］，能够水解亚胺培南、美罗培南和头孢菌素等多种临床常用一线抗菌药物，从而导致细菌多重耐药，对人类健康造成了严重的威胁。有研究显示［4］，KPC基因位于质粒上，易在同一菌种不同菌株甚至不同菌种之间移动，造成局部暴发甚至世界范围内的扩散。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）在巴西、中国台湾、日本、古巴等多个地区均有分离［5-8］。本研究对本院临床标本中CRKP的药物敏感性进行分析，以了解其耐药机制和流行特征。

1 材料与方法1.1 菌株来源 分离本院2017年1月至2018年6月临床标本中CRKP共189株。126株分离自痰液，23株分离自分泌物，20株分离自尿液，13株分离自全血，1株分离自脑脊液，6株分离自导管尖端。

1.2 试剂和仪器 Vitek 2 Compact 全自动细菌鉴定仪（法国bioMérieux公司），PCR扩增仪、Rotaphor System 6.0 脉冲场凝胶电泳仪、UVIBand PFGE 图像分析软件及紫外成像系统（德国Biometra公司），细菌多点接种仪（日本Oriental Motor公司），Taq酶及PCR相关试剂（日本TaKaRa），亚胺培南、美罗培南、厄他培南纸片（英国Oxoid公司），琼脂糖电泳仪。1.3 菌株鉴定及药敏试验 分离的细菌由Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定仪进行菌种鉴定及药敏试验。碳青霉烯类抗生素药敏采用琼脂稀释法测定其最低抑菌浓度（MIC）。根据美国临床和实验室标准化协会（CLSI，2016）的解释标准判断药敏试验结果。1.4 细菌耐药基因PCR扩增及序列分析 细菌基因组DNA提取：根据产品说明书，通过水浴裂解、去蛋白、异丙醇沉淀和洗脱等步骤完成基因组DNA快速抽提。PCR反应体系为：引物各10pmol，含MgCl2的dNTP8μl，10×Buffer 2 5μl，Taq酶0.5μl，0.1μg基因组DNA，无菌纯水补足至50μl。PCR反应条件为：94℃ 4min，1个循环；94℃ 1min，退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃充分延伸5min，1个循环。PCR产物在含EB的1.0%琼脂糖凝胶上100V恒压电泳30min，紫外灯下观察结果。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。所得DNA序列与GenBank中的数据库进行比对，确定耐药基因型。耐药基因的引物序列、扩增长度等相关信息见表1。

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐药机制及流行特征研究徐伟军 潘辉 陈西佳 赵褀

作者单位：318000 浙江省台州市中医院浙江临床医学2019年6月第21卷第6期·751·表1 耐药基因PCR扩增所用序列基因引物名称引物序列（5-3）扩增长度（bp）参考文献碳青霉烯酶基因blaKPC-2KPC-2FGCTACACCTAGCTCCACCTTC10503

KPC-2RTCAGTGCTCTACAGAAAACCblaIMIIMI-FATAGCCATCCTTGTTTAGCTC

IMI-RTCTGCGATTACTTTATCCTC81810blaIMP-1IMP-1-FTGAGCAAGTTATCTGTATTC

IMP-1-RTTAGTTGCTTGGTTTTGATG74010blaIMP-2IMP-2-FGGCAGTCGCCCTAAAACAAA

IMP-2-RTAGTTACTTGGCTGTGATGG73710blaVIM-1VIM-1-FTTATGGAGCAGCAACCGATGT

VIM-1-RCAAAAGTCCCGCTCCAACGA92010blaVIM-2VIM-2-FAAAGTTATGCCGCACTCACC

VIM-2-RTGCAACTTCATGTTATGCCG86510blaNDM-1NDM-1-FCTCGCACCGAATGTCTGGC

NDM-1-RCATTGGCGGCGAAAGTCA34111blaOXA-48OXA-48-FTTGGTGGCATCGATTATCGG

OXA-48-RGAGCACTTCTTTTGTGATGGC74410其它β-内酰胺酶基因blaTEMTEM-FTCGGGGAAATGTGCG

TEM-RTGCTTAATCAGTGAGGCACC97212blaSHVSHV-FGCCTTTATCGGCCTTCACTCAAG

SHV-RTTAGCGTTGCCAGTGCTCGATCA89812blaCTX-M-2组CTX-M-2-FCTCAGAGCATTCGCCGCTCA

CTX-M-2-RCCGCCGCAGCCAGAATATCC84312blaCTX-M-9组CTX-M-9-FGTTACAGCCCTTCGGCGATGATTC

CTX-M-9-RGCGCATGGTGACAAAGAGAGTGCAA88112

2 结果

2.1 CRKP药敏结果 本研究共分离到CRKP 189株，对亚胺培南耐药或中介耐药（MIC：2~128mg/L），对美罗培南和厄他培南均为耐药（MIC：4~128mg/L）。CRKP对头孢菌素、氨曲南、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、和左氧氟沙星呈高水平耐药，对多粘菌素E、替加环素敏感性较高（见表2）。表2 肺炎克雷伯菌药物敏感试验结果（%）抗菌药物敏感率中介率耐药率头孢吡肟0.00.0100.0阿米卡星11.50.088.5左氧氟沙星0.09.590.5多粘菌素E100.00.00.0头孢哌酮/舒巴坦0.020.879.2氨曲南0.00.0100.0哌拉西林/他唑巴坦0.03.396.7替加环素82.212.55.3

2.2 耐药基因检测结果 189株肺炎克雷伯菌均产KPC-2型碳青霉烯酶，未检出NDM与IMP型金属β-内酰胺酶，其中5株同时产VIM-1型金属β-内酰胺酶，blaCTX-M-9、blaTEM、blaSHV检出率均>60%。见表3。表3 耐药基因检测结果分析耐药基因种类耐药基因阳性率（%）碳青霉烯酶基因blaKPC-2100.0

blaVIM-112.5

其它β-内酰胺酶基因blaCTX-M-987.5

blaTEM64.1

blaSHV76.6

2.3 染色体DNA同源性分析 应用UVIBand软件对PFGE条带进行分析显示，共有2种分型（a型、b型），其中a型较多，占67.9%。（见图1）。

3 讨论临床研究显示，大部分产blaKPC肺炎克雷伯菌分离自入住ICU 病房、患有心脑血管疾病的老年患者，提示这类患者是感染或携带产KPC-2肺炎克雷伯菌的

高危人群［9］。本研究收集到携带CRKP的患者中106