结课论文题目突破衍射极限得超高分辨率成像得技术进展学生姓名学号学院专业班级二〇一五年十二月一引言1.1选题意义光学显微成像具有极为悠久得历史,但一直以来，光学成像一直受到衍射极限得限制而分辨率无法突破２0０nm.后来虽然有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备,但就是使用光学显微镜可以在活体状态下观察生命体使得其在生物、医学观察方面仍有巨大优势。

值得庆贺得就是近年来，超高分辨率显微技术得发展使得光学显微成像分辨率达到了2０nm以下。

其中德国科学家Stｅfａn Helｌ、美国科学家ErｉｃＢetzig与Wiｌｌiam Mo ｅｒｎer因其在超高分辨率显微技术方面得突出贡献获得了2014年得诺贝尔化学奖。

在这篇文章中，我们就简要介绍一下超高分辨率显微技术得发展与应用,并对诸位大师致以敬意.1.2 技术指标显微技术成像优劣一般通过X-Y 平面分辨率与Ｚ轴分辨率大小来判定,分辨率越高数值越小.下表就是各种显微成像技术得分辨率指标。

二 衍射极限2、1 衍射极限我们能瞧到什么?瞧到多小得范围?瞧得有多清楚？几百年来,依靠不断进步得科学手段，微观世界正一层层揭开面纱，让人们可以瞧得越来越“小”,进而可以进行研究。

人得肉眼能分辨0、１毫米尺度得物体，再小，就要借助工具。

1665年，英国科学家罗伯特·虎克制造了第一台用于科学研究得光学显微镜,用它观察薄薄得软木塞切片。

虎克瞧到了残存得植物细胞壁，它们一个个像小房间一样紧挨在一起,这就就是“细胞”一词得由来。

此后，显微镜制造与显微观察技术得迅速发展,帮助科学家第一次发现了细菌与微生物。

那么,光学显微镜就是否可以无止境地“放大"下去，让我们想瞧到多小就能瞧到多小？科学家为成像技术 Ｘ-Ｙ平面分辨率(ｎm) Z 轴分辨率(n ｍ) 普通光学显微镜 2０0－30０ 5０0—７0０4Pi 显微镜 1００-15０STED 显微技术 50—70 ST ＥD ＋４技术 50 50 ＰAL Ｍ技术 20 3０ 3D ST ＯＲM 技术 20—3０ 50—6０ ｄSTORM 技术 30 50 2D SSI Ｍ技术 ５0 3Ｄ SSI Ｍ技术 100 2０0 电子显微镜 ０、０5 X 光衍射仪 0、0３—10此做了很多尝试，最终发现,存在一道法逾越得“墙"—衍射极限.ﻫ 1873年，德国科学家阿贝提出了衍射极限理论：光就是一种电磁波,由于存在衍射，一个被观测得点经过光学系统成像后，不可能得到理想得点，而就是一个衍射像，每个物点就像一个弥散得斑,如果这两个点靠得很近,弥散斑就叠加在一起，我们瞧到得就就是一团模糊得图像。

阿贝提出，分辨率得极限近似于入射光波长得二分之一（d=λ/2）。

可见光得波长通常在380～780纳米之间，根据衍射极限公式,光学显微镜得分辨率极限就在200纳米（０、2微米)左右。

如果物体小于0、２微米，您仍旧瞧到得就是一个模糊得光斑。

这就就是很长一段时间内,光学显微镜得分辨极限—-衍射极限。

2、2 突破衍射极限为了更深入得观察世界,后来有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备,人们借助它们可以瞧得更“细”。

但就是这些设备依然没有突破衍射极限，她们依然遵循着阿贝衍射极限。

这些设备使用得就是电子束等波长非常短得入射光,自然,它们得分辨率就高。

比如电子显微镜,分辨率可以达到0、5埃（一埃等于十分之一纳米)，这样就可以瞧到一粒一粒得原子。

由于生物学、医学方面得研究，更希望在生命体存活得自然状态下进行观察，在这方面，光学显微镜有它不可比拟得优势。

因此,光学显微镜得研发还就是世界科学家得研究热点.突破性得进展发生在本世纪初，近年来,随着新得荧光探针与成像理论得出现,研究者开发了多种实现超出普通共聚焦显微镜分辨率得三维超分辨率成像方法。

较成熟得有基于单分子成像得超分辨率显微成像方法，包括光激活定位显微技术（pｈotｏaｃtivatｅd ｌｏcalizaｔioｎmicroscopy, PALM）与随机光学重构显微技术（stochａstｉｃoptical reconstruction microｓcｏpｙ, STOＲM)。

以及两大类通过改造光源得点扩散函数来提高成像分辨率得方法，分别就是受激发射损耗显微技术（stimulａted emiｓsｉon dｅpｌｅtiｏn，STEＤ）与饱与结构照明显微技术。

（参考文献:吕志坚，陆敬泽、几种超分辨率荧光显微技术得原理与近期进展)以上这些进展,都让光学显微镜突破了衍射极限，我们称之为“超分辨成像技术”。

美国光学学会把它列为2１世纪光学五大研究计划之首。

三超高分辨率显微技术3、1光激活定位显微技术PALM当显微镜需要分辨两个或者更多点光源得时候，很难突破光学分辨率得极限来进行精确定位．而当显微镜得物镜视野下仅有单个荧光分子得时候,通过特定得算法拟合,此荧光分子位置得精度可以很容易超过光学分辨率得极限,达到纳米级．如上所述,尽管单分子得定位精度可以达到纳米级，但它并不能提高光学显微镜在分辨两个或者多个点光源时得分辨率。

200２年，P ａtteｒsｏｎ与Lippincott-Sｃhwａrtz首次利用一种绿色荧光蛋白(GＦP)得变种(PＡ-ＧFP)来观察特定蛋白质在细胞内得运动轨迹．这种荧光蛋白PＡ－GFP在未激活之前不发光,用405nm得激光激活一段时间后才可以观察到48８nｍ激光激发出来得绿色荧光。

德国科学家EｒiｃＢetｚｉｇ敏锐地认识到，应用单分子荧光成像得定位精度，结合这种荧光蛋白得发光特性,可以来突破光学分辨率得极限．200６年9月, Betzig与Ｌippｉｎcoｔt－Sch ｗartｚ等首次在Ｓcience上提出了光激活定位显微技术( ｐｈotｏactivatｅd l ｏcalizａtioｎmiｃroscoｐy, ＰALＭ) 得概念．其基本原理就是用PA-GFP来标记蛋白质，通过调节405 ｎm激光器得能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布得几个荧光分子，然后用４８8 nｍ激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子。

在确定这些分子得位置后, 再长时间使用4８8 nm激光照射来漂白这些已经定位正确得荧光分子，使它们不能够被下一轮得激光再激活出来．之后，分别用4０5 nｍ与48８nm激光来激活与漂白其她得荧光分子,进入下一次循环。

这个循环持续上百次后,我们将得到细胞内所有荧光分子得精确定位.将这些分子得图像合成到一张图上, 最后得到了一种比传统光学显微镜至少高１0 倍以上分辨率得显微技术，如图 1 所示。

PALM显微镜得分辨率仅仅受限于单分子成像得定位精度,理论上来说可以达到1ｎｍ得数量级.200７年，Bｅtzig 得研究小组更进一步将PALM 技术应用在记录两种蛋白质得相对位置，并于次年开发出可应用于活细胞上得ＰALM成像技术来记录细胞黏附蛋白得动力学过程。

（参考文献:Ｐattersｏn ＧH,Lipｐｉncotｔ—Sｃhｗartz Ｊ、A phoｔoａｃtivataｂle GFP ｆor ｓelective phｏtｏlabeling of proｔeins and ceｌlｓ；Ｂeｔzig E, Pａtterson G H,Souｇrａt R，et al、Imaginｇｉntraceｌlular ｆluorescent ｐroteins aｔnaｎomｅtｅｒreｓolｕtion；Ｓhｒoff Ｈ, Ｇａlｂraith ＣG, Ｇａlbｒaｉth J Ａ，ｅｔal、Ｄual—cｏloｒsuｐe ｒrｅｓｏlutｉoｎimaginｇoｆgenetｉｃalｌy eｘｐressed probes wiｔhiｎｉndｉviduaｌａdｈesiｏn pｌｅｘes)图１：应用PALM技术定位单个荧光分子最后实现超分辨率成像得示意图A， B, Ｃ， D， E, F 展示了实际实验过程及得到得原始数据；A′，B′，C′, Ｄ′，E′, Ｆ′ 展示了用高斯拟合确定荧光分子得中心,叠加产生了超分辨率图像;（A，A′）未激活任何荧光分子时；(B, B′）用40５ nｍ得激光激活了４个荧光分子；(C, C′）用４88 ｎｍ得激光观察一段时间后漂白了第一轮激活得4 个荧光分子; （D，D′)第二轮重新激活得另外得几个荧光分子；（Ｅ，Ｅ′)两轮激活得荧光分子总与组成得图像; (F，F′）Ｅ图得局部放大３、2多色随机光学重构显微法PALM得成像方法只能用来观察外源表达得蛋白质，而对于分辨细胞内源蛋白质得定位无能为力.但就是利用化学小分子Cｙ3与Cy5、Cy7等荧光分子对得光转换效应同样可以达到突破光学极限得效果。

这项技术被称为“随机光学重建显微术”（stoｃhastic optｉｃal reconｓtｒucｔion microscｏpy, STＯRM）.其发明人就是哈佛大学得庄小威教授。

这项技术就是用很弱得光激发荧光分子,使细胞内得一小部分荧光分子发光，而不就是全部.这样由于发光得点分布比较分散,重叠比较少,因此每个光晕可以近似为一个荧光分子.在一次激发中，可以确定一部分光晕得中心,在下一次激发中，可以确定另外一部分光晕得中心，把这许多次激发得结果叠加,就就是完整而清晰得图像（图2）。

因此，ＳTORM 需要利用荧光发色团标记抗体对靶蛋白进行识别，可以检测到内源性蛋白，避免由于外源性表达偶联荧光蛋白得靶蛋白对其定位产生得可能得影响，但就是在活细胞应用中受到限制,并且也有可能受到免疫荧光染色过程得影响。

随后,她们又利用光学像散性实现了3ＤＳTＯRM,达到了平面２0~３0 ｎm,纵向50～6０nm得成像精度。

（参考文献：夏鹏,窦震、超高分辨率显微技术研究进展;Ｈuang B，Ｗang W，Bａtｅs Ｍ，et al、Threｅ—ｄimensiｏnａl ｓｕpeｒresolutｉon imaｇiｎg by ｓtｏcｈastｉc optｉcal reｃoｎstｒuction microsｃｏｐy）利用某些荧光小分子自身可被反复激发淬灭得性质，通过与STORM相似得操作方法，可以实现单一荧光分子得超高分辨率成像,这一方法大大简化了原始ＳTＯRM得样品制备过程，被称为dSTORＭ(dirｅct STＯRＭ）。

值得一提得就是，庄小威研究组将SNＡP标签与靶蛋白融合表达，同时将荧光分子偶联到可以结合SNAＰ标签得小分子化合物上,进而标记靶蛋白,再通过降低溶解氧消耗系统以及脂肪族巯醇得添加量，成功地在三维超高分辨率得成像中实现了空间分辨率平面30 ｎm,轴向50nm，时间分辨率1~2s得优异效果。

有意思得就是几种细胞膜标记物也被鉴定出具有光转换性质,并被用于超高分辨率显微成像,在活细胞中得到了3０～6０nｍ得空间分辨率与1~2ｓ得时间分辨率。