— 161 —CHINESE JOURNAL OF ANATOMY V ol.42 No.2 2019 解剖学杂志 2019年第42卷第2期二甲双胍对大鼠脊髓损伤后内质网应激和细胞凋亡的影响*郭卫东1，2 李 刚3 范仲凯1△（1 锦州医科大学附属第一医院骨科， 锦州 121001；2 空军军医大学唐都医院骨科， 西安 710000；3 同济大学附属上海第十人民医院骨科， 上海 200072）摘要 目的：研究二甲双胍（MET ）对大鼠脊髓损伤（SCI ）后内质网应激（ERS ）和细胞凋亡的影响，探讨二甲双胍对SCI 的保护作用及机制。

方法：成年雌性SD 大鼠随机分为3组，分别是假手术组（Sham 组）、单纯脊髓损伤组（SCI 组）和二甲双胍干预组（MET 组）。

采用Allen 方法制备大鼠SCI 模型，MET 组和SCI 组大鼠建模后，立即腹腔注射MET （50 mg ·kg -1·d -1）或等量生理盐水，连续处理7天后，取脊髓组织，用实时定量PCR 检测各组脊髓组织中葡萄糖调节蛋白78 （ GRP78），CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP ） 和半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-12（caspase-12）的mRNA 水平，免疫印迹检测各组脊髓组织中GRP78、CHOP 、caspase-12和active caspase-3的蛋白水平，免疫荧光染色检测各组脊髓组织中GRP78、CHOP 和caspase-12的蛋白水平，TUNEL 染色法检测各组脊髓组织中细胞凋亡水平，BBB 评分检测大鼠SCI 后运动功能情况。

结果：与Sham 组相比，SCI 组中GRP78、CHOP 和caspase-12的mRNA 和蛋白水平明显升高，active caspase-3蛋白表达和细胞凋亡数目明显增加，BBB 评分明显降低；与SCI 组相比，MET 组中GRP78、CHOP 和caspase-12的mRNA 和蛋白水平明显降低，active caspase-3蛋白表达和细胞凋亡数目明显减少，BBB 运动评分明显升高。

结论：二甲双胍可以抑制大鼠SCI 后细胞凋亡，促进后肢运动功能恢复，其机制可能与抑制ERS 有关。

关键词 脊髓损伤；二甲双胍；内质网应激；细胞凋亡；大鼠Effects of metformin on endoplasmic reticulum stress and apoptosisafter spinal cord injury in rats *Guo Weidong 1， 2， Li Gang 3， Fan Zhongkai 1△（1. Department of Orthopedics ， First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical College ， Jinzhou 121001； 2. Departmentof Orthopedics ， Tangdu Hospital of Fourth Military Medical University ， Xi'an 710000； 3. Department of Orthopedic ，No.10 Affiliated Shanghai People's Hospital of Tongji University ，Shanghai 200072， China ）Abstract Objective ： To detect the effects of metformin (MET) on ER stress and apoptosis after spinal cord injury (SCI) in rats. Methods ：Adult female SD rats were randomly divided into three groups ： sham group (Sham group)， spinal cord injury group (SCI group) and MET intervention group (50 mg/kg/day). SCI rat model was established at T10 section by Allen's weight drop method. Spinal cord tissues were harvested 7 days after spinal cord injury. Real-time quantitative PCR was used to detect the expressions of GRP78， CHOP ， and caspase-12 mRNA. The expression of GRP78， CHOP ， caspase-12， and active caspase-3 was detected by Western blotting and immunofluorescence labeling technique. The fluorescent TUNEL staining was used to detect apoptosis. The BBB score was used to detect the recovery of hindlimb motor function in rats. Results ：Compared with sham group ， the mRNA and protein levels of GRP78， CHOP ， and caspase-12 were significantly increased and so were the protein levels of active caspase-3 and the number of apoptosic cells ， while the BBB scores were decreased significantly in SCI group. Compared with SCI group ， the mRNA and protein levels GRP78， CHOP ， and caspase-12， and the protein levels of active caspase-3 were significantly reduced ， and the apoptosis had the same trend ； however ， BBB scores were increased significantly in MET group. Conclusion ： Metformin may inhibit the apoptosis ， and promote the recovery of hindlimb motor function by inhibiting endoplasmic reticulum stress after spinal cord injury in rats.Key words spinal cord injury ； metformin ； endoplasmic reticulum stress ；apoptosis ； rat * 辽宁省自然科学基金（201602277）；辽宁省高等学校优秀人才支持计划项目（LJQ2014091）第1作者 E-mail ：guoweidonggwd@△通信作者，E-mail ：fanzk_ln@收稿日期：2018-10-08；修回日期：2019-01-12doi ： 10.3969/j.issn.1001-1633.2019.02.012·论 著·脊髓损伤（spinal cord injury ，SCI ） 是脊柱外科常见疾病，由于人们尚未透彻地认识到SCI 的机制，导致至今仍未发现治疗SCI 的特效药物。

大量研究证实，SCI后出现神经细胞凋亡事件，抑制神经细胞凋亡可明显减轻SCI后的运动功能障碍[1]。

内质网（endoplasmic reticulum，ER）的主要功能是折叠和组装细胞内蛋白质，当其受损伤时会产生内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），在初期细胞会启动未折叠蛋白反应（enfolded protein response，UPR）以缓解ERS对细胞产生的危害[2]，但持续、剧烈的ERS会诱导细胞进入凋亡程序[3]。

二甲双胍是目前临床上治疗2型糖尿病的经典药物，但其除了降血糖外，还在多种中枢神经系统疾病中发挥治疗作用，包括帕金森病[4]、亨廷顿病[5]和缺血性脑损伤[6]。

最新研究表明二甲双胍可以明显减轻SCI后运动功能障碍，抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路[7]，减少了细胞自噬底物P62蛋白含量，同时上调微管相关蛋白Ⅰ轻链3Ⅱ（microtubule-associated proteinⅠlight chain 3Ⅱ，LC3Ⅱ）和Beclin 1表达，这表明二甲双胍对脊髓损伤的保护作用与促进细胞自噬体产生和增强细胞自噬降解有关，这两者共同维持了细胞内自噬体产生与降解过程平衡[8]，但关于其对SCI后的ERS的影响的报道非常少。

本课题通过检测二甲双胍对大鼠SCI后ERS及细胞凋亡的影响，探究其对SCI的保护作用及机制，为SCI损伤机制和干预靶点的选择提供重要线索。

1 材料和方法1.1 实验动物与试剂36只清洁级健康雌性SD大鼠（体质量250~300 g）购买于锦州医科大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK（辽）2008-000。

二甲双胍购自美国MedChem Express公司；兔抗大鼠葡萄糖调节蛋白78（ glucose-regulated protein 78-kD，GRP78）多克隆抗体（ab21685）、小鼠抗大鼠CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/ enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）单克隆抗体（ab11419）、兔抗大鼠半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-12（cysteinyl aspartate specific proteinase-12，caspase-12）多克隆抗体（ab62484）和兔抗大鼠活化型半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（active cysteinyl aspartate specific proteinase-3，active caspase-3）多克隆抗体（ab49822）均购自英国Abcam公司；小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体（sc-47778）购自美国Santa Cruz公司；HRP标记二抗山羊抗兔（7074P2）和山羊抗小鼠（7074P6）均购自美国Cell Signaling Technology公司；荧光标记二抗Alexa Fluor 488结合的羊抗兔IgG（A-11034）和Alexa Fluor 594结合的羊抗小鼠IgG（A-11005）均购自美国Life Technologies公司；增强型ECL化学发光试剂盒（WBKLS0100）和PVDF膜均购自美国Millipore公司；TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒（12156792910）购自瑞士Roche公司；Tissue-Tek O.C.T. Compound（4583）购自美国SAKURA公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；cDNA反转录试剂盒和SYBR® Green 反转录PCR试剂盒均购自大连TaKaRa公司。