作者简介:鲁国武(1977-),男,汉族,山东临沂市人,石河子大学生命科学学院硕士研究生,植物学专业,植物遗传方向。3通讯作者。 收稿日期:2007-03-30植物体细胞胚胎研究进展及研究基础鲁国武1　张　霞13王雪芬2　岳庆妮1　齐妍婷1(1新疆石河子大学生命科学学院,新疆石河子　832003;2陕西师范大学生命科学学院,陕西西安　710062)摘　要:本文简述了1958年发现植物体细胞胚胎以来显微结构、超微结构的细胞学和组织化学等理化特性研究进展,同时还简述了体细胞胚发生时蛋白质、氨基酸代谢,淀粉粒动态、过氧化物酶同工酶变化、酯酶同工酶变化等基础研究。关键词:体细胞胚胎;体细胞胚胎发生;细胞全能性;愈伤组织、过氧化物酶同工酶;酯酶同工酶;信号转导中图分类号　Q942 文献标识码　B 文章编号　1007-7731(2007)08-52-03 植物体细胞胚胎发生是指离体条件下植物的体细胞通过与合子胚发生相类似的途径,发育成新个体的过程。体细胞胚发生有两种方式,一种是不需要经过愈伤组织,直接从组织或细胞发生胚;另一种是经过愈伤组织阶段[1]。前者需要诱导物的合成或抑制物的消除从而恢复细胞分裂;后者需要诱导细胞重新进入细胞周期而进行发育的重决定。植物体细胞胚发生是一个错综复杂的发育过程,其实质是基因顺序表达的过程。1　植物体细胞胚胎研究进展1902年,德国著名植物学家哈勃兰德(GottliebHaber2landt)提出植物细胞全能性概念。1943年,怀特(White)正式提出植物细胞全能性理论,认为每个细胞都具有母株植物的全部遗传信息,都具有一套完整的基因组,具有发育成完整植株的能力[1]。1945年,Buvat认为组织脱分化有两步:首先逆转到形成层细胞状态,再次回复到初生分生组织细胞的细胞结构。1954年,缪尔(Muir)首次成功地进行了植物细胞悬浮培养。1955年,Skoog和Miller首次从酵母提取物中分离细胞分裂素激动素KT。1958年,Steward等和Reinert几乎同时在胡萝卜根组织单细胞悬浮培养中,发现某些体细胞在形态上转变为与合子胚相似的结构[2-4],其发育过程也和合子胚类似,但由于它是从体细胞分化而来,因而称之为体细胞胚或胚状态[1],并由此形成了再生植株,直到开花结果。这一重大突破不仅证实了植物细胞的全能性,而且为细胞离体培养中研究形态发生机制开拓了一个新的领域。1962年Murashige和Skoog发明了含最基本矿质元素和微量元素的MS培养基[5,6]。1982年Sharp认为可以通过预决定的胚性细胞(PEDC)诱导体细胞胚胎发生。1995年,Merkle认为体胚诱导发生的难易程度以及愈伤组织的大小、疏松程度等与外植体的基因型、生长期、生理状态和培养基的条件环境等因素有关[7]。1995年,Finer做了大量的实验并在前人工作研究的基础上总结了从根、茎、叶诱导体细胞胚胎发生的步骤,以供后期研究人员的参考。最近,日本的Kakimoto从拟南芥的体胚中发现细胞分裂素受体CTY1。植物学家对体细胞胚的发生机理进行了广泛的研究,在高等植物中通过体细胞胚发生途径形成再生植株已被证明是普遍的现象,无论是在裸子植物、双子叶植物还是单子叶植物上均有报道[8],早在1993年的统计,就已从210种植物中得到了胚状体。据不完全统计,全世界约有1000多种高等植物作过离体培养的研究,其中绝大多数可通过体细胞胚发生的途径形成再生植株,并在许多珍稀或重要树种上实现了体细胞工程育苗的产业化[9]。植物体细胞胚发生技术不仅成为植物快速繁殖的最重要的手段之一,而且已发展成为植物胚胎发生机理、遗传转化的重要系统。2　体细胞胚发生的细胞学及理化特性研究211　体胚发生过程中的细胞生物学研究21111　显微结构研究　石蜡切片法是体细胞胚胎发生研究中最常用的方法,该方法的优点是可以制作连续切片,跟踪体细胞胚发生全过程。取愈伤组织,经过FAA固定、冲洗、梯度脱水、梯度透明、渗蜡、包埋、修块、切片、粘片、平展、梯度脱蜡、染色、封片等一系列过程,最后在显微下观察和拍照,记录体细胞胚发生的不同阶段的结构动态变化。侯丙凯等在小麦的体细胞胚发生体系研究中,应用石蜡切片技术研究了胚状体的发生部位,结果表明,小麦胚状体来源于单个的原始胚性细胞,胚状体经历了从单细胞、胚性细胞团、球形胚、心形胚到成熟胚的发育过程,从而证明了胚状体的单细胞起源学说。在紫花苜蓿[10]、胡萝卜、大蒜[11]等的细胞学观察中都发现体胚发生经历从单细胞、2细胞、4细胞、8细胞、球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶成熟胚的发育过程。21112　超微结构研究　在超微结构的研究中,用小麦、棉花、枸杞[12]等植物为试材做了大量的工作。对胚性细胞半薄切片定位进行超薄切片,在超微研究中发现,在愈伤组织向体胚发生转化时,原体细胞中大液泡消失,细胞质电子密度加强,细胞核大,核仁明显;细胞器数量和种类增25安徽农学通报,AnhuiAgri1Sci1Bull12007,13(8):52-54加;细胞壁加厚,胞间连丝消失,胚性细胞中积累淀粉,细胞间联系不紧密;球形胚时期,胚体内细胞间广泛存在胞间连丝,细胞间重新建立了联系。利用扫描电镜观察发现,胚性细胞呈颗粒状,组成颗粒的细胞之间结合紧密无空隙,但细胞团之间结合疏松空隙较大,容易分离;非胚性细胞较小,形似纤维状细胞,细胞大多单个存在,细胞之间大多存在空隙,很少有细胞团存在。212　体胚发生过程中的生理生化特性的组织化学研究　将细胞学与组织化学结合起来,研究胚性细胞发育过程中糖类、蛋白质和核酸等大分子的代谢情况。外植体在各种激素的作用下,主要生化代谢物质会发生变化,包括蛋白质、氨基酸、可溶性糖类等,内源激素水平都会发生改变[13]。21211　蛋白质和氨基酸代谢　体细胞胚与合子胚的蛋白质组分相似,氨基酸组成也相似,占优势的氨基酸为天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)、赖氨酸(Lys),分化后期精氨酸(Arg)含量有所提高。Kamada在胡萝卜的研究中发现,氨基酸总量的增加及丙氨酸含量的升高是体细胞胚胎发生的标志,因为氨基酸是活跃蛋白合成的氮源,氮代谢变化的结果是诱导愈伤组织生长状态变化的生化基础[14]。烟草、拟南芥、龙眼等的特异蛋白双向电泳[15]和小麦的可溶性蛋白毛细管电泳[16]提高了分辨率和可靠性,可以通过鉴别体胚发生过程中的特异蛋白来了解体胚基因表达规律,探索体胚发生的分子机制。21212　淀粉粒动态　体细胞发生起源分内起源和外起源,在发生部位胚性细胞体积较小排列紧密,从一开始就积累大量的淀粉粒,淀粉粒体积较大,分布于细胞核周围或在细胞质聚集成团,。随着胚性细胞分化发育,淀粉粒数量逐渐减少,体积也变小,待形成几个原胚也就是前期结束时,淀粉已消耗殆尽。继续分化至球形胚时又有大量淀粉积累,至成熟子叶胚淀粉又逐渐减少。党参和石刁柏的淀粉代谢情况表明非胚性细胞基本不含淀粉粒,胚性细胞核周围出现淀粉粒,在胚状体的发育中,淀粉粒的积累有两次高峰,第一次在胚性愈伤组织形成后期,第二次在球形胚期。21213　过氧化物酶同工酶的变化　体胚的形成和胚数量变化过程中,过氧化物酶同工酶的数量和含量都会发生变化,维持基础代谢基本的氧化物酶同工酶有可能会稳定的出现,同时在不同的阶段又会伴随新的酶谱的出现和另一些酶谱的消失,组织在分化发育过程中,酶分子的重新合成或酶前体的活化致使新的酶的出现,酶的降解可以使某些酶谱带消失。在小麦、泡桐体胚发生过程中都出现过类似的现象[17,18]。体胚发生过程是大量酶特异性合成及参与的代谢结果,过氧化物酶同工酶与能量和呼吸代谢密切相关,根据体胚发生过程中过氧化物酶同工酶的活性和种类可以了解体胚发生需要的能量和呼吸强度。对进一步揭示体胚发生过程中蛋白质及DNA的变化有着重要的意义。21214　酯酶同工酶的活性变化　同工酶是来源于生物体结构不同而能催化同一反应的酶。酯酶同工酶的变化有利于愈伤组织向体细胞胚胎发生过程的培养基的筛选和细胞活性变化的分析,在不同的阶段、不同的组织中的脂肪酸组成是不同的,因此表现出特有的酶谱类型。酯酶同工酶谱能反应愈伤组织在一定的的环境下的适应能力及代谢能力。曾报到过四合木体胚发生过程中的酯酶同工酶的活性变化[19]。酯酶同工酶是不同阶段基因的表达产物,对酯酶同工酶的分析可以帮助探查基因的存在和基因的差异表达的时间和量的问题。21215　激素在体胚发生过程中的代谢变化　植物激素是调控体胚发生的重要物质,是影响愈伤组织细胞状态的重要调控因素。植物体细胞转化为胚性细胞的一个重要前提是必须脱离整体的约束而进行离休培养并有相应的激素来诱导其细胞分化。外源激素通过内源激素起作用,当愈伤组织的生长状态发生不断变化时,内源激素含量也发生一系列的变化。2,4-D在胚性愈伤组织的诱导中起着重要作用。2,4-D通过改变细胞内源IAA代谢而起作用[20]。ABA是体细胞胚发生中另外一种重要的激素。Kamada等在胡萝卜细胞培养中,发现内源ABA含量一直保持比较低的水平,但从非胚性细胞转化为胚性细胞阶段,伴随着内源ABA的增加[21]。在黄姜愈伤组织分化过程中,IAA和GA3含量上升时,胚性细胞开始形成,IAA达到高峰值时,也是胚性细胞产生的高峰期[22]。植物体细胞胚发生是一个复杂的发育过程,受到多种内外因素的影响和调节。影响体细胞胚发生的因素很多,除了与物种的遗传特性密切相关外,还受到培养基的矿质元素、激素成分、氮源、碳源及光照等多种因素的影响。3　信号转导系统与体胚发生生物体的生长发育主要受遗传及环境变化信息的调节控制。遗传基因决定个体发育的基本模式,但其实现在很大程度上受控于环境的刺激。细胞信号转导主要指胞间通讯的激素以及外界环境因子等作用于细胞表面或胞内受体后,如何跨膜传递形成胞内第二信使,以及其后的信息分子级联传递诱导基因表达和引起生理反应的过程[23]。如何控制细胞的基因表达及增殖、分化、发育是细胞信号转导研究的主要内容。体细胞胚发生过程包含着细胞分化、增殖两个关键时期。这两个时期的信号转导有助于揭示体细胞胚发生、发育的机理。激素的信号转导是从激素与其受体的结合到激素诱导基因表达的过程。植物的五大类激素可能首先与其受体结合,引起受体蛋白的构象的改变从而使其激活,激活的受体再引起某些特定的反应,最终导致特定基因的表达。4　小结体细胞胚发生是植物发育过程中的独特现象。胚胎发生的实质是受基因调控的,是基因按顺序表达的结果[24]。体细胞胚发育类似于合子胚发育,也受许多因素影响,植物在体胚胎发育的不同时期,基因的表达和表达35量是不同的,同时其产物蛋白质(包括酶)的组分及含量也是不同的,即在植物体细胞胚发生中的核酸、蛋白质和酶均为动态的变化过程。参考文献[1]崔凯荣,戴若兰1植物体细胞胚发生的分子生物学[M]1科学出版社,2000,8-10[2]StewardF1C1,M1O1M1,JoanSmith.GrowthandOrganizedDevel2opmentofCulturedCells1I1GrowthandDivisionofFreelySuspen2dedCellsAmericanJournalofBotany,1958,45(9):693-703[3]StewardF1C1,M1O1M1,KathrynMears.GrowthandOrganizedDevelopmentofCulturedCells1II1OrganizationinCulturesGrownfromFreelySuspendedCellsAmericanJournalofBotany,1958,45(10):705-708[4]StewardF1C1,M1O1M1,JoanSmith.GrowthandOrganizedDevel2opmentofCulturedCells1III1InterpretationsoftheGrowthfromFreeCelltoCarrotPlantAmericanJournalofBotany,1958,45(10):709-713[5]SkoogF,M1C1O1,Chemicalregulationofgrowthandorganforma2tioninplanttissueculturedInVitro1Symp1Soc1Exp1Biol,1957,(11):118-131[6]MKRazdan,S1S1B1,IntroductiontoPlantTissueCulture[M]1INtercept,2006,2:63-74[7]MerkleSA,P1W1A1,FlinnBS.MorphogeneticaspectsofsomaticembryogenesisKluwerDordrecht,1995,155-205[8]Mathieu,M1,etal1Germin-likegenesareexpressedduringsom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