- -- - . -考试资料- 国的溶菌酶的应用与发展

溶菌酶,又称胞壁质酶。球蛋白G、N - 乙酰胞壁质聚糖水解酶。最早对溶菌酶的研究起于 N icolle 1907 年发表的枯草芽孢杆菌中的溶解子,1922年 Flem ing等发现,在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶,因而被命名为溶菌酶 [1] 。1965年,英国的菲利普等用 X衍射法对溶菌酶进行研究分析,第一个完全弄清了溶菌酶的立体结构 [ 2 ]。此后人们发现溶菌酶广泛地存在于高等动物组织及分泌物，植物及各种微生物中,其中在新鲜的鸡蛋清中含量最高。溶菌酶可选择性地分解微生物细胞壁的同时不破坏其它组织,且本身无毒无害,因而它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂,防腐剂,将可应用于食品防腐、医药制剂 日用化工等行业。在我国,溶菌酶的应用围和应用量还比较有限,但可以预计，溶菌将会是应用于我国食品工业中一种重要的功能性食品添加剂。 溶菌酶的结构特点和抗菌作用机制结构特点与复杂性 大多数鸡蛋清溶菌酶是由129个氨基酸组成的碱性球状蛋白 ,相对分子量在14000 ～18000。其等电点可达 10 7,存在 4 个二硫键。正常条件下溶菌酶作用的最适温度为45℃～50 ℃。蛋清溶菌酶在低温干燥下可长期保存。其纯品为白色粉末状结晶,无臭、味甜 ,易溶于低浓度的食盐水。在碱性条件下易被破坏,但在酸性溶液中其化学性质稳定,热稳定性很强 ,在 pH4 ～7 时,100℃下处理1m in 酶仍保持良好的活性,在pH3时,100℃加热处理 45m in 仍能保持活性 {3}。溶菌酶在水溶液中6215 ℃下,维持30min则完全失活,在20- -- - . -考试资料- 15%的乙醇中,在 6215 ℃下维持 20m in而不失活[4]。王玮等[5]研究表明。在一元醇和二元醇溶液中溶菌酶分子的稳定性均随着醇浓度的增大而提高。人溶菌酶分子量为14600,由130个氨基酸组成 ,也存在4个二硫键,其酶活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍左右。在生产或应用溶菌酶时,由于工艺或环境的变化,极易造成酶的变性失活,因此必须采取一定的手段使蛋白复性，减少损失。史晋辉等[7]研究发现 ,当酶浓度较低时,017mol/L 的盐酸胍即可使溶菌酶完全复性。此外 , 溶菌酶和其它酶具有相似的性质 , Karupp iah等[8]研究表明,向复性溶液中加入适量的β- 环糊精,可使变性的碳酸脱水酶的复性率达到80% 。董晓燕等[9]利用β-环糊精和十六烷基三甲基溴化的联合作用,在适宜盐酸胍浓度下,溶菌酶可完全复性。王彦等利用离子交换色谱法研究发现,当复性缓冲液中不含其它盐类时,脲浓度为 210mol/L时复性产率最高,当脲浓度高时,硫酸铵能很好地提高溶菌酶的复性回收率。 溶菌酶的抗菌作用机制 目前已知的几种溶菌酶有:- N -乙酰己糖胺酶、酰胺酶β-1,3、β-1,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、几丁质酶、磷酸甘露糖酶脱、乙酰壳多糖酶[11]。参与细菌细胞壁溶解作用的溶菌酶大致可分为作用于糖苷键和作用于肽和酰胺部分的两类。- N -乙酰己糖胺酶、β- 1, 3、β 1, 6葡聚糖酶等主要作用于糖苷键,使糖苷键断裂,破坏细胞壁的分子结构,而酰胺酶等则主要作用于多肽,使多肽断裂。以 - N - 乙酰己糖胺酶为例,- N-乙酰己糖胺酶能够催化水解细胞壁肽聚糖分子中的 - -- - . -考试资料- N-乙酰胞壁酸(NAM )与 N-乙酰葡萄糖氨(NAG)之间的β- 1, 4糖苷键,使肽聚糖分子发生断裂,使细胞壁外两侧渗透压失衡,造成细胞破裂,导致微生物因细胞壁溶解而被杀死[12]氏阳性菌由于两者细胞壁中肽聚糖含量不同而存在差异,G+细胞壁含80%肽聚糖,而 G-细胞壁只有在壁层含有少量肽聚糖。 结晶法是传统的提取溶菌酶的方法,此方法原料易得,制备过程不是很烦琐。起先 M ayerAbraham 等研究并利用此法,于1937年获得结晶状物质[13],1945年A lderton等提出直接结晶法制备溶菌酶的方法[14]。景芝等[15]对传统结晶法做出了改进,通过调整透析液 pH 值 ,加入磷酸盐,再调整其pH 值,然后离心去除杂质得到纯化液,使产率提高,活性增加。 离子交换层析法 离子交换层析法是根据各种蛋白质所带电荷数的不同而与离子交换剂之间结合力的差异,进而将不同蛋白质分离的技术。该法应用于溶菌酶分离始于 80年代,由于其操作简便、高效、成本低、可自动化连续操作的优点,一直以来都是溶菌酶生产的常用方法[16]。目前国外常用的离子交换剂有 Duolite - 464、724、732弱酸性阳离子交换树脂、D903、201 大孔离子交换树脂、羧甲基纤维素 ( CMC ) 和羧甲基琼脂糖等[17]。宋宏新等[18]采用 724树脂,装柱后抽提液缓慢流入柱中,用缓冲液洗涤，再用硫酸铵洗脱,结果表明724树脂的吸附率达到8315%。由于Duolite - 464非常适合于连续自动化操作,因此利用它来分离纯化溶菌酶,可取得较高的产率。如LiChan等 [19]用- -- - . -考试资料- Duolite-464从性质均一的蛋清溶液中分离溶菌酶,使溶菌酶的回收率达 90 % ～ 95 %。 亲和层析法 亲和层析法是根据酶与作用底物的特异性亲和能力,利用酶分子独有的专一性结合位点或结构性质的分离方法 [ 20 ] 。它的应用始于

上世纪70年,由于底物可以专一性与溶菌酶结合,进而与其它蛋白分离,是一种高效的分离方法。目前利用亲和层析法分离溶菌酶的报导很多,如HeLZ等[21]采用多步亲和层析法分离纯化溶菌酶,结果表明,利用三亲和过滤系统从原料中纯化溶菌酶,与一步法相比产率从 61%提高到96%。 超滤 超滤是一种新兴分离纯化技术,利用控制超滤膜孔径大小来滤过杂质,水及小分子物质可以通过,从而获取产物。在反渗析及浓缩等工艺中广泛应用,同时在蛋白质分离中应用也开始兴起。与传统生化分离技术相比,它的优点是产品的产出量高、杂质少、纯度相对较高。在 2000年,GhoshR等[22]采用小型的中空纤维超滤系统( 30 kDa MWCO , 聚砜膜)从蛋清干粉中分离溶菌酶,溶菌酶选择性透过膜,而其它大分子蛋白质被膜所截留。溶菌酶的粗提液经过超滤技术后,有时部分杂质如无机离子等未能全部除去若将超滤与结晶法,或是与离子交换法等结合将取得精制溶菌酶。邹艳丽等[23]报道,超滤浓缩溶菌酶经CM - Sepharose FF阳离子交换柱后,纯度提高2119倍。灏等[24]研究表明,将磷酸盐缓冲液稀释10倍,在24M Pa下均质,利用截留- -- - . -考试资料- 相对分子质量为30000的聚醚砜( PES)膜进行超, 溶菌酶制品活力达到 14610u /mg 溶菌酶活性的测定 目前,国外对溶菌酶活性的测定方法,主要有比浊法、紫外分光光度法、比色测定法、琼脂火箭糖电泳法和高效液相色谱法等,但上述各种方法中均存在一定的缺点,如比浊法干扰因素多,重复性差,对单个样品测定速度快,比色法操作简单但误差较大,因此,各种方法都在不停改进中。传统方法测定溶菌酶活性时要将溶微球菌制成冻干粉,此过程不仅步骤烦琐而且易造成细菌大量死亡,影响结果。玉萍等 向溶壁微球菌直接加保护剂(20%的甘油)置于普通采取了类似的方法。采用聚苯乙烯微量反应板,建立了微量快速比浊检测溶菌酶的方法, 使标本用量减少,反应时间缩短,灵敏度较好。近年来,许多报道采用标记乙二醇化几丁冰箱冷冻,使用时解冻,读第1min的吸光度值和第 2min的吸光度值即可。使溶菌酶的测定方法更加节约高效,准确性又好。 溶菌酶在食品、生物医药等工业中的应用 溶菌酶作为一种天然蛋白质 , 能在胃肠被消化和吸收 , 对人体无毒害作用 ,是一种安全系数很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品。由于溶菌酶具有良好的理化特性 , 具有一定的保健作用 , 如在化妆品中用可消除粉刺 , 使皮肤滑嫩 ,促进皮肤的新代; 有止血 , 促进组织再生的作用 , 如在牙膏中添加可防止牙龈出血、保护牙龈并具有杀菌作用。因此溶菌酶的应用领域非常广泛 , 在食品、- -- - . -考试资料- 医药、生物工程等方面都具有很大的应用前景。此外,溶菌酶除作为医药原材料外,仅在食品防腐、强化方面市场就比较可观 , 如乳制品、肉制品、酒类发酵、水果防腐等方面。随着对溶菌酶的研究的深入和应用产品的不断开发,溶菌酶一旦被人们认识接受,其对市场的占有率将大幅提高。 溶菌酶在食品中的应用溶菌酶在乳制品中的应用 人乳与牛乳的最大差别之一在于溶菌酶的含量,在欧洲溶菌酶已经广泛用于婴儿食品添加剂,将一定量的溶菌酶添加到牛乳及其制品中 ,使牛乳人乳化,能够强化血清灭菌蛋白,γ-球蛋白等防御因子,抑制肠道中腐败性细菌的增殖,增强婴儿对病菌的抵抗力。因此,在牛乳或奶粉中添加一定量溶菌酶,不但防腐,而且强化营养,有利于婴儿健康成长。此外,在奶酪产业溶菌酶也被广泛使用,如在干酪生产中替代硝酸盐,加入 01001%的溶菌酶,可防止干酪产气,保持香味物质丁酸。德国于1995年11月22日发布了奶酪法规,批准使用溶菌酶来阻止在半硬奶酪的生产中由厌氧孢子增殖所引起的胀气现象。 溶菌酶在肉制品中的应用 低温肉制品由于口感鲜嫩,营养丰富,获得消费者的喜爱。但由于肉类冷藏的温度,并不能彻底杀死微生物或抑制其生长,因而保鲜期短,不能满足消费者需求。溶菌酶本身无毒、无害 ,可替代如苯甲酸及其钠盐等化学防腐剂添加到肉制品中,能有效延长食品保质期。 采用0105%溶菌酶和 0105% N isin 混合液保鲜猪肉,4℃下可保鲜 12d,真空包装保鲜期可达 24d。在此基础上添加了18% NaCl和415%