２００６年第３４卷第１１期（总第１９２期）表１乳酸菌Ｌ３和Ｌ４无细胞提取物的抗氧化活性（ｎ＝３，Ｘ±ＳＤ）抗氧化活性ＤＰＰＨ自由基清除率／％脂质过氧化抑制率／％超氧自由基清除率／％羟自由基清除率／％对Ｆｅ２＋螯合还原活性（Ｌ－半胱氨酸）／μｍｏｌ・Ｌ－１乳酸菌Ｌ３５０．１７１．８１４．９８３．５（５４．３±２．１）×１０－６（２００．０±３．６）乳酸菌Ｌ４４８．１７５．２８７．０４５．７（４１．３±１．９）×１０－６（１８７±２．３）０引言正常情况下，体内自由基的产生和清除是平衡的，一旦体内自由基代谢失衡，就会导致细胞损伤并引发一些疾病，如糖尿病、高血压、关节炎、心血管疾病、癌症等［１－３］。这时外加一些抗氧化物质对协助体内氧代谢的平衡是很有帮助的。国内外对乳酸菌抗氧化活性的研究较少。在体外实验中，Ｌｉｎ等［４］研究发现嗜酸乳杆菌与长双歧杆菌的无细胞提取物对亚油酸过氧化反应有抑制作用；Ｋｕｌｌｉｓａａｒ等［５］利用人体实验报道了发酵乳杆菌ＭＥ－３在具有抗氧化活性；Ｙａｎｇ［６］等的研究证明，与发酵前相比，乳酸菌发酵豆奶的还原活性及清除ＤＰＰＨ自由基的能力明显提高。在前期的研究中，已经从３０株乳酸菌中筛选到了抗氧化活性相对较高的乳酸菌Ｌ３和Ｌ４，发现它们的无细胞提取物有清除氧自由基，抑制亚油酸过氧化作用等［２］，见表１。本研究进一步对这２株乳酸菌的抗氧化活性物质进行分析，利用ＰＣＲ技术鉴定了乳酸菌Ｌ４的超氧化物歧化酶（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）基因及其表达，并对其发酵乳的抗氧化作用，如还原活性，螯合Ｆｅ２＋作用，清除ＤＰＰＨ自由基作用进行了分析，以期对抗氧化乳酸菌L4的SOD活性及其发酵乳的抗氧化作用张江巍，曹郁生，刘晓华，徐波（南昌大学中德联合研究院食品科学教育部重点实验室，江西南昌３３００４７）摘要：从３０株乳酸菌中筛选出的抗氧化活性相对较高的乳酸菌Ｌ３和Ｌ４进行实验，发现乳酸菌Ｌ４的抗Ｈ２Ｏ２的能力明显要高于乳酸菌Ｌ３和保加利亚乳杆菌。并检测到乳酸菌Ｌ４无细胞提取物ＳＯＤ活性为（７３．７０±１．７７）Ｕ／ｍｇ。但未检测到乳酸菌Ｌ３和Ｌ４具有ＧＳＨ－Ｐｘ活性。利用ＰＣＲ技术扩增了乳酸菌Ｌ４的ＳＯＤ基因，通过ＤＮＡ序列测定，发现乳酸菌Ｌ４的ＳＯＤ基因与Ｅ．ｃｏｌｉ的Ｍｎ－ＳＯＤ基因有高度的同源性。并发现乳酸菌Ｌ４发酵乳的还原活性和螯合Ｆｅ２＋作用均明显高于未发酵乳。关键词：乳酸菌；超氧化物歧化酶；发酵乳；抗氧化中图分类号：Ｑ９３６文献标识码：Ａ文章编号：１００１－２２３０（２００６）１１－００１２－０４ＳＯＤＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａＬ４ａｎｄｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆｉｔｓｆｅｒｍｅｎｔｅｄｍｉｌｋＺＨＡＮＧＪｉａｎｇ－ｗｅｉ，ＣＡＯＹｕ－ｓｈｅｎｇ，ＬＩＵＸｉａｏ－ｈｕａ，ＸＵＢｏ（Ｓｉｎｏ－ＧｅｒｍａｎＪｏｉｎｔＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＮａｎｃｈａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＴｈｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｎａｎｃｈａｎｇ３３００４７，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓａｉｍｅｄａｔｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｓｔｒａｉｎＬ３ａｎｄＬ４ｔｈａｔｄｉｓｐｌａｙｅｄｅｘｃｅｌｌｅｎｔａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｍｏｎｇ３０ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ．ＳｔｒａｉｎＬ４ｗａｓｌｅｓｓｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏＨ２Ｏ２ｔｈａｎｏｔｈｅｒｓ．Ｔｈｅｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｆｏｕｎｄｉｎｔｈｅｃｅｌｌ－ｆｒｅｅｅｘｔｒａｃｔｓｏｆＬ４（７３．７０±１．７７Ｕ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ），ｂｕｔｔｈｅｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｗａｓｎｏｔｆｏｕｎｄｉｎＬ３ａｎｄＬ４．ＴｈｅＳＯＤｇｅｎｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｗｉｔｈＰＣＲｆｒｏｍｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｏｆＬ４，ａｎｄｔｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｗａｓｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＳＯＤｇｅｎｅｉｎＧｅｎｅｂａｎｋ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＳＯＤｇｅｎｅｆｒｏｍＬ４ｉｓｈｉｇｈｌｙｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＭｎ－ＳＯＤｇｅｎｅｏｆＥ．ｃｏｌｉ（９８％）．ＴｈｅｍｉｌｋｆｅｒｍｅｎｔｅｄｂｙＬ４ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｂｅｔｔｅｒＦｅ２＋ｃｈｅｌａｔｉｎｇａｂｉｌｉｔｙａｎｄｒｅｄｕｃｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｔｈａｎｕｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｍｉｌｋ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ；ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ；ｆｅｒｍｅｎｔｅｄｍｉｌｋ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ收稿日期：２００６－０４－１９作者简介：张江巍（１９８１－），男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。ｗｗｗ．ｃｈｉｎａｄａｉｒｙ．ｎｅｔｒｐｇｙ＠ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．ｃｎ中国乳品工业１２Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１１２００６（ｔｏｔａｌ

１９２）ＲｅｓｅａｒｃｈＰａｐｅｒｓ研究报告乳酸菌抗氧化的机制及其在发酵乳中的作用进行初步的探讨。１材料和方法１．１材料１．１．１菌种及培养基乳酸菌Ｌ３和Ｌ４为实验室保藏菌株，嗜酸乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ），保加利亚乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）菌株，ＭＲＳ培养基。１．１．２试剂ＤＰＰＨ自由基和Ｌ－半胱氨酸，ＳＯＤ和ＧＳＨ－Ｐｘ检测试剂盒，Ｔａｑ酶和ｄＮＴＰｓ，ＣＴＡＢ，ＤＮＡ纯化试剂盒，ＦｅＳＯ４，Ｏ－菲罗啉及其他试剂均为分析纯试剂。１．２主要仪器紫外可见分光光度计，３Ｋ１８高速冷冻离心机，超声波破碎机，超纯水系统，２７００ＰＣＲ仪，全自动灭菌锅，ＦＲ－２０００凝胶成相系统，培养箱等。１．３方法１．３．１乳酸菌对Ｈ２Ｏ２的敏感性［７］乳酸菌Ｌ３和Ｌ４采用液体ＭＲＳ培养基，３７℃静置培养２４ｈ，离心收集菌体，悬浮于ＰＢＳ中，其中分别含有０，２×１０－３，３×１０－３，５×１０－３，１×１０－２的Ｈ２Ｏ２，３７℃处理１ｍｉｎ，再用质量浓度为０．２ｇ／Ｌ的Ｈ２Ｏ２酶处理，然后用ＰＢＳ梯度稀释，涂布于ＭＲＳ固体培养基上，３７℃培养４８ｈ，然后计数并计算其存活率。其中以抗氧化活性较低的保加利亚乳杆菌作为对照菌。１．３．２乳酸菌无细胞提取物的制备参考文献［２］，以考马斯亮兰法测定蛋白质量分数。１．３．３乳酸菌抗氧化活性物质的检测超氧化物歧化酶（ＳＯＤ），谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）活性用试剂盒检测。１．３．４ＰＣＲ技术鉴定乳酸菌Ｌ４的ＳＯＤ基因（１）乳酸菌Ｌ４基因组ＤＮＡ的提取。－基因组ＤＮＡ的提取采用ＣＴＡＢ法，参考文献［８］中的方法进行。１％的琼脂糖凝胶电泳检测。（２）引物设计与合成。－从ＧｅｎＢａｎｋ数据库中查出乳酸菌ＳＯＤ基因序列，进行同源性分析，依据保守序列，设计并合成一对引物ＰＳＯＤ１：５′ＣＣＡＧＡＴＣＴＴＴＣＣＴＡＣＧＣＴＴＡＣＧＡＴＧＣＴＴＴＧ３′ＰＳＯＤ２：５′ＡＣＧＧＴＡＴＴＴＴＡＧＧＴＡＧＴＡＡＧＣＡＴＧＴＴＣＣＣＡ３′（３）ＰＣＲ扩增。扩增按照常规进行ＰＣＲ。扩增条件：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ，５２℃退火２ｍｉｎ，－７２℃延伸１ｍｉｎ，７２℃终延伸１０ｍｉｎ。３０个循环。ＰＣＲ完毕后用１％的琼脂糖凝胶电泳检测。（４）ＰＣＲ扩增产物的序列测定及同源性分析。ＰＣＲ扩增产物经ＤＮＡ回收纯化试剂盒纯化后送上海生工公司进行ＤＮＡ序列测定，测序结果用ＮＣＢＩ的ＢＬＡＳＴ工具进行同源性检索分析。１．３．５发酵乳抗氧化活性的测定（１）发酵乳对ＤＰＰＨ自由基的清除能力参考文献［９］中的方法进行。１ｍＬ的样品，加入１ｍＬ的ＤＰＰＨ甲醇溶液（０．２ｍｍｏｌ／Ｌ），室温反应３０ｍｉｎ后，用三氯甲烷抽提，抽提后加入同体积的甲醇后，于５１７ｎｍ测吸光度。其中去离子水作为空白。（２）发酵乳的还原活性参考文献［１０］中的方法进行测定。（３）发酵乳对Ｆｅ２＋螯合作用能力参考文献［１０］中的方法进行测定。２结果与讨论２．１乳酸菌对Ｈ２Ｏ２的敏感性Ｈ２Ｏ２是一种强的氧化剂，本研究测定了在不同浓度的Ｈ２Ｏ２中乳酸菌Ｌ３，Ｌ４和保加利亚乳杆菌的存活率。从图１可以看出，当用２×１０－３的Ｈ２Ｏ２处理后，乳酸菌Ｌ３，乳酸菌Ｌ４和保加利亚乳杆菌的存活率分别为４０％，７０％和２０％；当用１×１０－２的Ｈ２Ｏ２处理后，乳酸菌Ｌ３和保加利亚乳杆菌的存活率几乎为０，乳酸菌Ｌ４的存活率为３．６％。图１不同乳酸菌对过氧化氢敏感性实验２．２乳酸菌抗氧化活性物质的检测本研究在测定ＳＯＤ活性时，定义每毫克蛋白在１ｍＬ反应液中ＳＯＤ抑制率达５０％时所对应的ＳＯＤ量为一个ＳＯＤ活力单位。由表２可以看出，乳酸菌Ｌ３的ＳＯＤ活性为（２．４２±０．９２）Ｕ／ｍｇ，而乳酸菌Ｌ４的ＳＯＤ活性为（７３．７０±１．７７）Ｕ／ｍｇ。但未检测到乳酸菌Ｌ３和Ｌ４具有ＧＳＨ－Ｐｘ活性。本研究已经检测到乳酸菌Ｌ４有高ＳＯＤ活性。常规方法检测ＳＯＤ酶分型需要一些抑制剂，如氰化钾ＳＯＤ活性ＧＳＨ－Ｐｘ活性乳酸菌Ｌ３２．４２±０．９２未检测到乳酸菌Ｌ４７３．７０±１．７７未检测到表２乳酸菌Ｌ３和Ｌ４抗氧化活性物质的检测（ｎ＝３，Ｘ±ＳＤ）Ｕ／ｍｇ１３

２００６年第３４卷第１１期（总第１９２期）（ＫＣＮ）。这里采用ＰＣＲ法，目的是对乳酸菌Ｌ４的ＳＯＤ基因进行分析鉴定，并与其他细菌ＳＯＤ基因进行比较。比较了几种方法提取乳酸菌Ｌ４的基因组ＤＮＡ，结果表明，用ＣＴＡＢ法效果最好，在１％的琼脂糖凝胶电泳图中可以看到乳酸菌Ｌ４基因组ＤＮＡ清晰的条带（图２）。然后以乳酸菌Ｌ４基因组ＤＮＡ作为模板进行ＰＣＲ扩增，扩增出一条ＤＮＡ片段，大小为４９６ｂｐ，与预计大小一致，见图３。泳道Ｍ：λ－ＨｉｎｄⅢｍａｒｋｅｒ；泳道１：基因组ＤＮＡ图２乳酸菌Ｌ４基因组ＤＮＡ电泳图泳道Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；泳道１：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ图３ＰＣＲ法检测乳酸菌Ｌ４的ＳＯＤ基因电泳图ＰＣＲ扩增产物经试剂盒纯化后进行ＤＮＡ序列测定，用ＢＬＡＳＴ工具进行同源性检索分析，发现乳酸菌Ｌ４的ＳＯＤ基因与Ｅ．ｃｏｌｉ的Ｍｎ－ＳＯＤ基因的一致性达９８％，Ｔａｋｅｄａ等克隆并表达了此Ｅ．ｃｏｌｉ的Ｍｎ－ＳＯＤ基因［１１］。见表３。２．３发酵乳抗氧化作用的测定图４为８种乳及乳制品对ＤＰＰＨ自由基的清除作用的比较结果。从图４中可以看出，市售品牌酸奶对ＤＰＰＨ自由基的清除作用要略高于乳酸菌Ｌ３和Ｌ４发酵乳，其中品牌３酸奶的清除率为５８％，而用乳酸菌Ｌ３和Ｌ４各５０％（体积分数）混合发酵乳的清除率为５６％，比用单菌株发酵乳的清除率要略高。而未发酵纯牛奶对ＤＰＰＨ的清除率却为最高７３％。图４８种乳及乳制品对ＤＰＰＨ自由基的清除作用的比较图４中，Ａ为市售品牌纯牛奶，Ｂ为市售品牌酸奶１，Ｃ为市售品牌酸奶２，Ｄ为市售品牌酸奶３，Ｅ为乳酸菌Ｌ４发酵乳，Ｆ为乳酸菌Ｌ３发酵乳，Ｇ为乳酸菌Ｌ３和Ｌ４各５０％（体积分数）混合发酵乳，Ｈ为嗜酸乳杆菌发酵乳，下同。图５为８种乳及乳制品还原活性的比较结果。由图５中可以看出，乳酸菌Ｌ４发酵乳的还原活性为最高，相当于１２０μｍｏｌ／Ｌ的Ｌ－半胱氨酸，市售的３种酸奶的还原活性均较低。而乳酸菌Ｌ３和Ｌ４各５０％（体积分数）混合发酵乳的还原活性比乳酸菌Ｌ３发酵乳的还原活性略高。但未发酵纯牛奶还原活性为最低，相当于３５μｍｏｌ／Ｌ的Ｌ－半胱氨酸。图６为８种乳及乳制品对Ｆｅ２＋螯合作用能力的比较。由图６中可以看出，乳酸菌Ｌ４发酵乳对Ｆｅ２＋螯合作用为最高，螯合率为６０．１％，明显高于其他乳及乳制品对Ｆｅ２＋的螯合能力，而未发酵纯牛奶对Ｆｅ２＋的螯合率为４．８％，品牌２酸奶的螯合率为最低的４．１％。图５８种乳及乳制品还原活性的比较结果图６８种乳及乳制品对Ｆｅ２＋螯合作用能力的比较表３乳酸菌Ｌ４的ＳＯＤ基因测序分析结果ＧｅｎＢａｎｋ登录号Ｘ０３９５１Ｍ９４８７９Ｕ２０６４５相似性／％９８９７８８具有高度相似性的基因Ｅ．ｃｏｌｉＭｎ－ＳＯＤ基因Ｅ．ｃｏｌｉＭｎ－ＳＯＤ基因ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＭｎ－ＳＯＤ基因研究报告ＲｅｓｅａｒｃｈＰａｐｅｒｓ１４