第35卷第8期高分子材料科学与工程Vol.35,No.8
2019年8月POLYMERMATERIALSSCIENCEANDENGINEERINGAug.2019
氧化石墨烯修饰壳聚糖药物载体的构建张中勋,刘 霞,刘 杨,邓林红(常州大学生物医学工程与健康科学研究院,江苏常州213164)
摘要:采用化学交联法制备了氧化石墨烯/壳聚糖(GO/CS)药物载体,并进行红外光谱、扫描电镜、孔隙率、吸水率、力学
性能测试,研究了引入GO以后对CS理化性能及载药性能的影响。结果表明,GO和CS发生了有机结合,制备的GO/CS药物载体具有均匀的孔洞结构。相比于CS,GO/CS的孔径和孔隙率有所提升,引入GO之后该材料具有较好的保湿
性能,尤其力学性能得到显著提升。此外,采用阿仑膦酸钠对材料的载药性及生物相容性进行了研究,结果表明,引入GO后材料的载药性能得到提高,对比单纯的CS,GO/CS的载药率提升了6.3%;MC3T3细胞实验结果表明,细胞能很
好地在材料上黏附生长,在细胞接种7d后,细胞能与材料很好地结合。
关键词:壳聚糖;氧化石墨烯;阿仑膦酸钠;药物载体中图分类号:R318.08 文献标识码:A 文章编号:1000-7555(2019)08-0137-07
doi:10.16865/j.cnki.1000-7555.2019.0218收稿日期:2018-08-27
基金项目:国家自然科学基金项目重点项目(11532003);国家自然科学基金项目面上项目(31670950);江苏省科技厅自然科学基金面上项
目(BK20171196);江苏省教育厅自然科学基金面上项目(15KJB310001);常州市基础研究计划项目(CJ20180059)
通讯联系人:刘杨,主要从事生物医用材料,材料表面化学改性等研究,E-mail:liuyang@cczu.edu.cn
骨缺损是临床常见疾病之一,通过骨移植物或骨修复支架材料对骨缺损部位进行修复和替代是临床常见的方式。自体骨具有良好的组织相容性、免疫排斥反应较低等优点,目前仍然是治疗骨缺损的黄金标准,但是该方法由于供体不足受到极大的限制[1]。骨支架材料是治疗骨缺损的可行性方案,因此,在过去的几十年里引起了许多研究者极大的兴趣[2,3]。多孔支架可以为细胞提供较好的微环境,具有与骨相似的结构,是一种有较好应用前景的骨移植物[4]。壳聚糖(CS,Fig.1(a))作为天然高分子材料具有良好的生物安全性、生物可降解性和骨传导性等
优点,在医学、药学及食品加工等领域被广泛应用[5,6]。然而,单纯的壳聚糖基支架材料的力学性能
较差,其应用受到了限制[7]。氧化石墨烯(GO,Fig.1
(b))是石墨烯的氧化产物,除了具有较大的比表面
积外,还有良好的力学性能,据报道,在CS中引入GO能提升材料的力学性质[8,9]。Khan等[10]还发现
壳聚糖/氧化石墨烯薄膜中不同相对分子质量的CS
对支架的力学性能有较大的影响,高相对分子质量的CS复合材料展示出较高的拉伸强度和弹性模量。
Fig.1 Chemicalstructureof(a)chitosan,(b)grapheneoxideand(c)alendronatesodium 但是,在现有的骨修复材料中,当其植入之后往往需要引入一些促进骨修复的药物以提升材料的修复能力[11]。Lai等[12]通过低温3D打印技术在聚乳
酸聚羟基乙酸/磷酸三钙中引入淫羊藿苷,制备了具有良好生物相容性、生物可降解性和成骨能力的聚乳酸聚羟基乙酸/磷酸三钙/淫羊藿苷(PTI)复合支架,该支架在激素类股骨头坏死疾病治疗中显示出较好的促进作用。阿仑膦酸钠(AL,Fig.1(c))是双膦酸盐类药物,可促进成骨细胞的增殖和成熟,抑制破骨细胞的骨吸收,被广泛用于代谢性骨疾病的临床治疗,如佩吉特氏病、质疏松症、恶性肿瘤的高钙血症及炎症相关的骨丢失[13,14]。然而,AL在胃肠道中的吸收较快,往往需要患者禁食,而对于一些需要长期治疗的患者在治疗过程中可能要停药[15]。鉴于此,本研究通过化学交联法,在CS中引入GO以改善支架材料的力学性能,并以AL作为药物负载模型,构建负载AL的氧化石墨烯/壳聚糖(GO/CS-AL)药物载体,并对构建的药物载体进行了微观结构观察、理化性能分析和生物相容性的研究。1 实验部分1.1 原料与试剂壳聚糖(CS):脱乙酰度≥95%,黏度200mPa·s,阿拉丁试剂;碳酸氢钠:99.8%,阿拉丁试剂;N-羟基琥珀酰亚胺(NHS):98%,阿拉丁试剂;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC):98%,阿
拉丁试剂;噻唑蓝溴化四唑(MTT):生兴生物;α-MEM培养基:Gibco公司;胎牛血清:Gibco赛默飞
世尔科技(中国)有限公司;氧化石墨烯(GO):98%,
上海源叶生物科技有限公司提供;冰醋酸:分析纯,国药集团化学试剂有限公司;氢氧化钠:分析纯,国药集团化学试剂有限公司。1.2 材料的制备
首先,配制3%的CS溶液与6mg/mLGO水溶液,然后,以5%EDC为交联剂,以5%NHS(均为质
量浓度)为催化剂,对GO的-COOH与CS的-NH2进行共价连接,并磁力搅拌过夜,同时控制
m(EDC)∶m(NHS)∶m(CS)=1∶1∶6。之后将
GO/CS水凝胶转入模具,在冷冻干燥机中冷冻干燥
48h,得到GO/CS支架。
负载AL的材料制备方法同上,向CS与GO/CS
水凝胶中加入3mL30mg/mL的AL溶液,磁力搅拌均匀后转入模具放入冷冻干燥机中冻干。其中氧化石墨烯/壳聚糖负载阿仑膦酸钠记为GO/CS-AL,
并以负载阿仑膦酸钠的壳聚糖作为对照组,记为CS-AL。
Fig.2 SchematicdiagramofthemechanismpreparationofCS-ALandGO/CS-AL1.3 测试与表征
1.3.1 FT-IR测试:采用傅里叶变换红外光谱仪
(NicoletiS50,Thermofisher)对冻干的
CS-AL
和
GO/CS-AL以KBr压片法制样进行官能团测试,红
外扫描范围为400~4000cm-1
。
1.3.2 形貌观察:将
CS-AL和GO/CS-AL
支架放
在样品台上喷金处理,加速电压5kV,采用场发射扫
描电子显微镜(FESEM,SUPRA55,Zeiss)观察其微
观结构。1.3.3 力学性能测试:采用生物材料力学性能试验
机(BoseELF3200,美国BOSE公司)对CS-AL和GO/CS-AL的力学性能进行测试。
1.3.4 孔隙率测试:
CS-AL和GO/CS-AL
支架的
孔隙率(P)通过液体置换方法计算。将质量Ms的支架浸入乙醇中,真空脱气,使乙醇充盈于多孔支架的孔中,称量样品质量为Mw
。测量圆柱形支架的尺寸
(包括半径(R)与高度(H)),使用式(1)计算支架的
孔隙率:P=
(Mw-MS)/ρethanol
π×R×R×H
(1)
831高分子材料科学与工程2019年 式中:Mw———药物载体充盈乙醇之后的质量;Ms———药物载体的原始质量;ρethanol———乙醇密度;R,H———分别为圆柱形支架的半径和高。质量为M0的CS-AL和GO/CS-AL支架放入PBS(pH=7.4)溶液中浸泡一定时间取出,之后用滤纸轻轻吸去材料表面溶液,称量溶胀之后的样品质量Mw(n=5),测其吸水率(S)。吸水率计算公式为:S=Mw-M0M0(2)式中:Mw———药物载体吸水之后的质量;M0———药物载体的原始质量。1.4 载药率和药物体外释放实验取一定量的CS-AL和GO/CS-AL药物载体溶解在2%的HAc溶液中,离心取上清液,测定溶液中AL的浓度,从而得到材料的载药率。AL浓度检测根据文献[16]报道的方法测定。即将收集的上清液溶于氯化铁/高氯酸溶液中,使用紫外-可见分光光度计(UV-2800,UNICO)检测AL浓度。载药率(DL)计算公式为:DL=m2m1(3)式中:m1———载体制备时投入AL的原始质量;m2———载体中AL的质量。将CS-AL和GO/CS-AL载体分别放入6mLPBS(pH=7.4)溶液中,在37℃振荡培养箱中进行AL体外释放试验。一定时间收集3mL样品上清液并补充等量的新鲜PBS,用紫外-可见分光光度计测定上清液中溶液的OD值,从而计算AL药物含量,得到AL的体外累积释放浓度。1.5 生物相容性测试将CS-AL和GO/CS-AL药物载体灭菌之后浸入10mLα-MEM完全培养基(含有10%胎牛血清)中,于37℃环境中放置24h得到载体浸提液。将MC3T3细胞用胰酶消化离心,用新鲜培养基重悬细胞密度为5×104mL-1,接着将100μL细胞悬液接种到96孔培养板中,在37℃,5%CO2环境中培养24h,之后轻轻吸出培养基,向每孔中加入100μLCS-AL和GO/CS-AL浸提液,其中浸提液每2d更换1次,细胞培养7d。在第1d、2d、3d、5d和7d分别取出一块细胞培养板,向每孔中加入20μLMTT(5mg/mL)溶液。将培养板放回37℃,5%CO2培养箱中培养4h,之后吸出培养基,加入150μL二甲基亚砜溶解甲瓒,然后将培养板放置在摇床上室温摇动10min。用酶标仪(Infinitef50,瑞士)测
定溶解液在492nm处的吸光值。MC3T3细胞在CS-AL和GO/CS-AL载体的增
殖和活力使用荧光染色法进行分析。用无菌PBS清洗CS-AL与GO/CS-AL载体3次后照射紫外30
min灭菌。然后向有CS-AL和GO/CS-AL载体的
24孔培养板添加200μL细胞悬液,其中细胞数量为
5×104个/孔,并在37℃,5%CO2环境中培养。培
养一定时间后,用罗丹明标记的鬼笔环肽染色1h,
DAPI染色3min。通过荧光显微镜(CELLOB-
SERVER,Zeiss,德国)观察CS-AL和GO/CS-AL
载体上染色的细胞。
2 结果与讨论
2.1 药物载体的理化性能
为了验证CS中是否成功引入了GO成分,进行了红外分析。Fig.3所示为CS-AL(a)和GO/CS-AL(b)的红外光谱图。从Fig.3(b)中可以看出,3423
cm-1峰变宽可能是O-H和N-H键伸缩振动峰重合
造成的,表明复合材料中含有较多的O-H和N-H
键。1154cm-1和898cm-1附近为糖苷键(C-O-C)的特征峰,表明复合材料中含有
CS
成
分。相对于CS-AL,GO/CS-AL在1648cm-1、1578
cm-1、1321cm-1附近出现的3个峰,是GO的
-COOH和CS的-NH2反应生成的酰胺键引起的,
其峰位分别归属于酰胺I(C=O伸缩振动),-NH2
中N-H弯曲振动与酰胺II(C-N)和酰胺Ⅲ(C-N
伸缩振动峰,N-H弯曲振动)的重叠峰,同时1258cm-1出现的峰是阿仑膦酸钠中P=O的伸缩振动峰,