・组织工程・组织工程的研究现状张　晨3　张　东3　高景恒3 十九世纪和二十世纪中叶,生物学的两大发现是细胞和DNA的双螺旋结构,标志着细胞生物学和分子生物学的形成,它们是现代医学发展的两个重要里程碑。

近二十年来,在国际上兴起了一门由生物医学和工程学技术相结合的边缘学科,即生物医学工程学(B i om edical Engineering),它的基础研究涉及自然科学的各个领域,并随着自然科学各个学科的进步而取得令人瞩目的进展。

目前,已着手进行人工合成和复制生命物质,并且日趋工程化,这正是现代医学区别于以往生物科学的显著特点,因此可望成为现代医学发展的第三个里程碑。

在人工复制的还原组织、器官的研究方面,一门新的学科正在产生,即组织工程(T issue Engineer2 ing)。

它是应用生物学和工程学的原理,研究开发能够修复、维持或改善损伤组织功能的生物替代物的一门科学[1～3],方法是将体外培养的高浓度的功能相关的活细胞种植于天然的或人工合成的细胞外基质(extracelluar m atrix,EC M),然后将它们移植到动物体内,达到形成新的有功能的组织的目的[4～11]。

1　组织工程提出的历史背景现代外科的发展已使人类替换病损组织的梦想成为现实。

替换物包括异种、同种异体以及自体组织和人工合成物质,但这些替代物由于种种问题而不能满足临床需要;异种组织引起的相当快速的排斥反应;同种异体移植尽管在形态方面与自体移植相似,在术后早期可被宿主短时间接受,但排斥反应不可避免,且组织器官的来源有限;自体组织移植会造成供区损伤以及所能供给组织的局限性;人工合成物质植入后所引起的异物反应,继发感染及裸露等,3　辽宁省人民医院整形外科(辽宁沈阳,110015)这些都迫使科学家们寻求新的、更为理想的组织替代物。

早在本世纪50年代,市场上可应用的营养素(nutrients)和酶可将组织离解为有功能的细胞成份,从而开始体外细胞培养的研究。

细胞工程(Cellu2 lar Engineering)的诞生使大规模细胞培养成为可能。

进入80年代以后,随着组织类型培养技术(h is2 to typ ic culture techniques)的普及,对体外细胞间的相互作用进行了研究,并预示了重建有功能的组织的到来[8]。

2　组织工程的研究现状组织工程一经提出,引起了世界范围的关注。

在美国,从1988年起,就由国家科学基金会(T he N a2 ti onal Science Foundati on),以研究基金和资助方式建立一系列实验室[5]。

日本也发展相应的研究[2,4,12,13]。

1989年在全美力学工程学会(T he Am erican Society of M echanical Engineers)的冬季年会上,日、美两国还就组织工程举行了专题讨论会。

到目前为止,关于组织工程方面的研究主要包括下面三方面内容:①细胞外基质替代物的开发;②种子细胞性质的研究;③组织工程化组织(tissue engi2 neered tissue)对各种病损组织替代的研究。

2.1　细胞外基质替代物的研究组织是由形态相似,功能相关的细胞和细胞间质即EC M所组成,EC M是细胞附着的基本框架和代谢场所,因此,它的形态和功能直接影响其所构成的组织的形态和功能,其替代物的研究也就成为组织工程的研究焦点之一。

2.1.1　人工合成的EC M替代物的研究　常用于组织工程的两种EC M替代物是聚乳酸(po lylatic acid,PLA)和聚羟基乙酸(po lyglyco lic acid, PGA),后者又称聚脂肪酸或聚乙二醇酸[5,7,9,14～17]。

由于这两种聚合物(po lym er)在体内能够逐步分解为小分子,并通过体内代谢排出,因此称为人工合成的生物可降解性聚合物(synthetic bi odegradable po lym er),亦称生物可吸收性人工聚合物(bi oabo rbable artificial po lym er)。

PLA在体内降解后生成乳酸,是体内糖代谢的产物,它有三种异构体,即P2L2LA,P2D2LA和P2DL2LA。

PGA在体内降解后生成羟基乙酸,易于参加体内代谢。

其它用于组织工程的EC M替代物有羟基磷灰石(hydroxyapatiet)、聚酣(po lyanhydrides)和聚乙磷酸二酯(po lypho sphoesters)。

应用这些EC M替代物的聚合物模板为植入的细胞提供了可控制的环境,并控制细胞的生长。

它可以做为人工合成的基膜(basem ent m em brane)用于细胞附着并成为移植复合物的内在结构。

使用人工聚合物可以不断向聚合物上增加侧链,这样在聚合物分解后仍可向细胞输送营养和激素[8]。

从这种形式上讲,这种聚合物模板也是人工合成的聚合物框架(synthetic po lym er scaffo lding)或是人工合成的聚合物基质(syntheticpo lym er m atrix)。

V acanti[18]使用人工合成的生物可吸收的聚合物作为基质,选择性地移植了肝细胞、胰腺细胞和肠细胞,肝细胞和肠细胞移植成活,但未能证实这些细胞在新的环境下是否发挥了功能。

C i m a[5]用同样的方法证明了肝细胞和软骨细胞都可用此种方法移植到小动物体内。

M iko s[19]研制了分层三维生物可降解泡沫,这种具有精确解剖形态的聚合物,种植细胞后可以重建和再生组织及器官。

已进行的研究表明,在设计这种细胞移植载体时,应考虑下列四点:①聚合物的表面化学和表面微结构,它们影响细胞的附着、生长和正常的功能;②聚合物的渗透性(po ro sity)和宏观尺度(m acroxcop ic di m ensi on),这些因素影响移植细胞的营养和运输;③形态,影响如软骨类组织移植后的形态;④受区的选择,因植入物可能的血管化程度而影响其体积。

现在为止,取得最佳效果的替代物是由直径15Λm间隔150～200Λm的聚羟基乙酸纤维组成的厚度为100Λm左右的无纺网(nonw ovenm esh)[7～10,20]。

作为EC M替代物,聚合物仍有其不足之处。

首先,聚合物作为一种人工材料是一种异物,植入体内可引起不同程度的炎性反应[18]。

其次,它也同样会遇到医用硅胶所遇到过的问题,免疫原性问题,致癌性问题[21]。

2.1.2　天然的细胞外基质的研究　EC M的主要成份为基质和纤维,前者布满纤维与细胞之间,起到调节细胞外液的化学组成,促进创伤愈合和润滑作用。

主要成份是氨基多糖(又称粘多糖)。

后者则由胶原纤维、弹性纤维和网状纤维组成,组成的比例依组织的不同而各异,但这三种纤维的主要组成部分是一种为胶原的蛋白质,因此不难想象,胶原可以作为细胞工程中EC M支架(scaffo lding)。

在人工皮的研究方面,Bell等1981年和1983年,先后将新生儿包皮细胞和真皮的成纤维细胞与牛的EC M 型胶原混合,上面附以人的表皮细胞制造出人工皮。

随后将其用于临床试验和化妆品的毒性试验研究。

Yannas等开发出另一种真皮,它是一种多孔的胶原基质模板(h ih ly pouous co llagen m a2 trix temp late)将其覆盖在创面上,周围的组织内成纤维细胞向模板的孔内渗透并产生新的胶原,此时植入的基质慢慢地溶解,创伤周围的上皮细胞向中央生长覆盖创面。

在人工血管的研究方面,W einberg[14]用胶原和培养的血管细胞制作出血管模型。

M atsuda[4]以胶原纤维基质和硫酸软骨素B的复合物作基底膜,胶原纤维网相嵌肌细胞为肌层,研制出人工血管。

但是,在天然的细胞外基质的研究方面,尚有不同来源的蛋白基质的力学性质较差,生理学性质不稳定和外来胶原所引起的免疫反应等问题未能解决。

2.2　对种子细胞的研究组织的主要成份是形态相似,功能相关的细胞。

移植后的组织工程化组织能否实现被替代组织的功能,种子细胞(sceded cell)能否适应受区的环境,种子细胞的浓度对组织工程化的影响,是研究中的一个焦点。

替代血管(substitute blood vessel)能否适应血管系统本身的动力作用产生的力学环境的影响,直接影响其植入后的功能。

Kanda[12,13]将牛主动脉的平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞种植在聚氨甲基酸乙酯透明弹力膜上,用振幅为5%～20%、频率为15～120R P M的拉力作用24h,结果发现,受力细胞与拉力成直角,且与细胞种类无关,平滑肌细胞和成纤维细胞的反应较内皮细胞的反应快,但细胞的形态没有变化。

种子细胞的浓度对组织工程化的组织有一定的影响。

Puelacher[17],将牛软骨细胞分别以每毫升2, 10,20及100万个细胞种植入10mm×10mm×0.5mm的人工聚合物框架上。

95.6%的移植物有新软骨形成,无细胞种植的移植物,无软骨形成。

植入后显示浓度为每毫升10,20及100万个细胞的软骨湿重、厚度明显增加。

组织学分析显示细胞出现在自体嗜碱基质包绕的陷窝内[17]。

2.3　组织工程还原的组织探索组织工程的最终目的是在体外预制组织、器官,并将这种有生机的具有功能的组织器官植入体内以取代因疾病、损伤而无功能的组织。

2.3.1　仿真组织还原　仿真组织还原即用组织工程的技术,从形态、宏观、微观结构及其功能方面整体还原组织,主要包括软骨、骨、皮肤和血管。

软骨组织是文献报道最多的用于组织工程的组织[5～11,17,20]。

因软骨只含有一种细胞即软骨细胞,这种细胞可以大量分离出来并易于成活,软骨细胞的耗氧最低,是肝细胞耗氧量的2%,在活体内可以不需要血管而通过扩散作用获得营养。

杀死动物数天后仍可以从其体内获得软骨细胞并大量繁殖。

软骨细胞在适宜的培养基中,4℃冰箱内可保存30d,且具有功能。

Sittinger[22]用细胞聚合物复合体(cell2po lym er)体外培养后,通过电子显微镜观察,发现试管内有典型的三股螺旋结构的胶原纤维,对分化的软骨细胞和 型胶原特异的单克隆抗体可使软骨细胞和细胞间基质着色,从而证实这种方法可使软骨还原。

随着软骨组织工程的实现,用来替代承重的关节面软骨、气管软骨、全关节成形、软骨替代骨鼻中隔软骨等[5～9,11,12]动物实验研究先后报道。

值得一提的是V acanti用组织工程技术按预先设计的人耳形态预制了人耳软骨,使得在体外按照预先设计形态重建缺损组织移植物成为可能。

骨组织的组织工程是用取自骨膜的成骨细胞种植于聚合物基质(po lym er m atrix)进行了还原。

他们首先将细胞一聚合物放入培养基中培养,10d后培养基上清液分析证实骨钙素(o steocalcin)存在,从而肯定了成骨细胞具有功能。