壳聚糖的制备
甲壳素是许多甲壳类动物 (如虾、蟹)及昆虫等外壳的重要组成成分 ,同时也存在于菌类的细胞壁中，还可来源于有机酸类，抗生素与酶酿造副产物。甲壳素是一种十分丰富的天然资源 ，在自然界蕴藏量仅次于纤维素。它不溶于水和酸性介质，甲壳素脱乙酰后形成壳聚糖（CTS）。其溶解性较甲壳素大。它是生物合成的天然高分子,又可生 物降 解, 安全 无毒, 有良好的生物相容性且化学 性质稳定, 具有许多独特的优点 。壳聚糖广泛 应用 于纺织、印 染、皮革、涂料、卷烟、塑料、化 妆品食品医药保健彩色胶卷造纸、生物工 程、农业植 保、污 水处理等。壳聚糖的脱乙酰度是一项极为重要的技术指标之一壳聚糖的脱乙酰度的高低,直接关系到它在稀酸中的溶解能力、粘度离子交换能力、絮凝性能和与氨基有关的化学反应能力,以及许多方 面的应用。壳聚糖的英 文名: chitosan, 化学名: ( 1, 4) - 二氨基 - 2- 脱氧 - B - D- 葡聚糖, 其它中英文名尚有 Deacetylated ch itin、F lonac N、甲壳胺、可溶性甲壳质、脱乙酰甲壳素、脱乙酰几丁质聚氨基葡糖可溶性甲壳素、粘性甲壳素等。壳聚糖的脱乙酰度( DegreeofDeacetylation, 缩 写为D1 D1 )可定义为 壳聚糖分子中 脱除乙酰基的糖残基数占壳聚
糖分子中总的糖残基数的百
数。脱乙酰度的测定方法很多,如碱量法 (包括酸碱滴定法、电位滴定法、氢溴酸盐法等 )、红外光谱法 、折光指数法、胶体滴定法、热 分析 法、气 相 色谱法、元素分析法、紫外光谱一 阶导数 、苦 味酸分光光度法等。常用的有酸碱滴定法、红外光谱法、紫外光谱法、电位滴定法等 。
一、壳聚糖的制备
将虾壳去腿去杂质后 , 流水冲洗 ,洗净残余的虾肉 ,于 60℃烘箱中烘干，用研钵磨碎.称取 10 g虾壳 3份 ,于 100 mL 5 %
HCl中浸泡 4h至无气泡冒出 ,再补加 50 mL 5 %HCl ,浸泡 2h ,除去虾壳中的钙质和无机盐 ,抽滤用去离子水洗至中性 ,加 100 mL
10 % NaOH于50℃水浴中加热 2h ,除去蛋白 ,过滤 ,用去离子水80℃水浴中反应 4 h ,水洗至中性 ,抽滤 ,烘干后得白色粉末状甲壳素分别为2.08,2.00,2,12g，平均产率为20.6%。
二、壳聚糖制备工艺的设计
甲壳素碱液质量和体积比一般选取 m甲壳素(g)∶ NaOH (ml)为 1∶20 ,碱液浓度在 30 %以下 ,脱乙酰反应进行得非常缓慢 ,温度超过
120℃时 ,脱乙酰虽然进行得较快 , 但是因此会造成主链的大幅降解 ,故实验中采用 30 %～60 %的浓碱 ,控温在 90～120℃进行反应。即可的壳聚糖。
三、壳聚糖的纯化
将所得粗品壳聚糖溶于 2 %HAc水溶液中 ,配成 1. 5 %～2.
0 %的壳聚糖醋酸水溶液 ,滤去不溶杂质 ,搅拌下缓慢滴入 4 %NaOH溶液 ,调节 pH值至 8～9 ,放各洗 2次 ,真空干燥 ,得壳聚糖纯品。
四、脱乙酰的测定
1.碱量法
甲壳质脱乙酰基后生成的甲壳素中的胺基呈游离态,属伯胺 ,具有阳离子性质 ,可与酸定量反应生成盐 ,且胺基特别稳定 ,即使在
50 %氢氧化钠溶液中，在 150℃也不会分解 ,基于上述特性来测定脱乙酰度。准确称取 0. 2 g样品置于 250 ml三角烧瓶中 ,加入 0.
2 mol/ L盐酸标准溶液 25 ml ,搅拌 0. 5～1 h完全溶解 ,以甲基橙作指示剂 ,0. 2 mol/ L氢氧化钠标准溶液滴定过量的盐酸至终点 ,另取 1份样品于 105烘箱中至恒重 ,测定样品含水量。
这种方法简单 ,但由于达到终点时 ,壳聚糖析出沉淀 ,使终点判定容易产生误差 ,尤其在样品摩尔质量较大情况下更是如此 ,从而导致实验的重复性差。而且样品受溶解度影响较大 ,有时需加热才能使样品完全溶解 ,这样使盐酸挥发 ,测定结果受到影响。但这种方法不需大型仪器 ,操作简便易行 ,经常操作 ,积累一定操作经验 ,会改善重复性差的缺点。
2. 电位滴定法
准确称取 0. 2 g壳聚糖 ,溶于 25 ml 0. 2 mol/ L氢氧化钠标准溶液回滴过量盐酸 ,作 pH - V NaOH曲线 ,用三切线法确定终点 ,按碱量法的公式计算脱乙酰度。此方法操作简单 ,分析速度较快 ,终点判断清楚 ,精确度较高 ,对具有较高脱乙酰度的样品来说 ,应是一个较为可供选择的方法。
3. 紫外光谱法
其作用的原理是选择合适的染料使之与壳聚糖作用 ,在一定波长下测定吸光度 ,根据吸光度与浓度的关系 ,经简单的数学处理得到一标准曲线 ,利用这一标准曲线 ,可以测定与此壳聚糖具有同一脱乙酰度的未知壳聚糖的含量。人们对染料的变色作用早在 19世纪就有了认识。B. D.Gummow和 G. A. F. Roberts[报道了阴离子染料酸性红 88与壳聚糖的作用。酸性红 88这种带负电荷的染料与壳聚糖大分子上质子化的氨基以 1∶1的化学计量形成络和物 ,此时酸性红 88的最大吸收波长为 505 nm ,吸光度达到最低点 ,可以定量利用这一变色作用。本文用酸性红 143 ,与已知含量壳聚糖作用 ,测定未知含量壳聚糖。
(1)壳聚糖标准溶液的配制 : 准确称取 0. 1504 g日本产壳聚糖 ,溶于 100 ml 0. 1 mol/ L HCl ,准确称取 5 ml ,10 ml ,15
ml ,20 ml ,25 ml此溶液 ,用0. 1 mol/ L的 HAC溶液定容至 250
ml。
(2)染料标准溶液的配制 : 称取酸性红 0. 5 g143溶于 0. 1
mol/ L HAC溶液中 ,并稀释至 1 000ml。
(3)壳聚糖的测定 : 移取等份染料溶液 2 ml于 50 ml容量瓶中 ,分别从各浓度的壳聚糖标准
溶液中准确移取不同体积的标样。用 0. 1 mol/ LHAC稀释至
50 ml。以 2 ml染料 ,用 HAC定容为50 ml的溶液为空白 ,吸收波长为 530 nm ,于Perkin - Elmer紫外分光光度计测定吸光度 ,作吸光度对各浓度的壳聚糖标样体积的曲线 ,分别得到两条直线 ,直线交点处所对体积为质子化氨基与染料离子等量反应所需相应壳聚糖标样的体积
。
(4)数据处理 :用已知不同量的壳聚糖为横坐标 ,用图 1中直线交叉点处所对应的壳聚糖溶液的体积的倒数为纵坐标作图 (见图
2)。
五、分子质量的测定
目前国内外研究降解甲壳素的方法有很多，有酶降解法，化学降解法，物理降解法等。每种降解方法都有一定的局限性 ,化学降解法会对环境造成污染 ;酶的价格昂贵 ,不易得到 ,且具有选择性；物理降解法虽然对环境没有污染，但降解效率太低。H2O2有很强的氧化性 ,可以氧化甲壳素主链上的壳素氧化降解法制备低分子量的甲壳素。
1.利用 H2 O2制备低分子量分布的壳聚糖
将虾皮用 HCl浸泡去除碳酸钙盐 ;再用稀碱除去蛋白质得甲壳素 ;然后浓碱在 50℃与其反应 ,并控制反应时间 ,分别制备出脱乙酰度为 85% , 93% , 99%的壳聚糖 ,最后用 H2 O2氧化不同脱乙酰化壳聚糖 ,得到不同低分子量的壳聚糖。
2．低聚壳聚糖的制备
取样品按 壳聚糖∶水= 1∶30 (质量∶体积 )将其分散在水中。在 50℃下加热 ,用滴液漏斗慢慢滴加一定体积、浓度为 30%的H2 O2 ,并不断搅拌 ,在 30 m in内滴加完毕。反应 6 h后 ,抽滤得固相产品 ,水洗 ,烘干称重。用粘度法测定相对分子量。
2. 壳聚糖粘度与分子量的关系
低粘度样品在滴定过程中呈澄清溶液状态 ,测定值偏差较小 ;而粘度较高的样品 ,在滴定过程中易出现凝集现象 ,使测定结果偏差较大。所以在测定粘度较高的样品时 ,样品量不宜太大 ,在 0. 3
g左右即可 ,而且用少量蒸馏水稀释。以 85%脱乙酰度未降解 CTS为例 ,配制不同浓度的 85%脱乙酰度的CTS,用乌氏粘度计测定其粘度 ,结果见图 1。
1 测定方法
准确称取 105e 烘干至恒重的样品 01 3~ 01 5 g壳聚糖样品,
置于 250 m l 三 角 瓶 中, 加 入 01 1 m ol/L 盐 酸 标 准 溶
液
30 m ,l 在 20e ~ 25e 搅拌至溶解 完全 ( 若粘 度太大可 加适量加蒸馏水稀释 ), 加入 2~ 3 滴混合 指示剂 ( 1% )甲 基橙+( 1% )苯胺蓝 ( 1B2 ), 用 01 1 m ol/L 氢氧 化 钠
标准 溶 液滴 定 游离 盐酸。
式中：
C1) 盐酸标准溶液的浓度, mol/L
C2) 氢氧化钠标准溶液的浓度, mol/L
V1 ) 加入的盐酸标准溶液的体积, m l
V2 ) 滴定耗用的氢氧化钠标准溶液的体积, m l
G) 样品重, g01 016) 与 1 m l 1 m ol/L盐酸溶液相当的氨基量, g91 94% ) 理论氨基含量
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