基质金属蛋白酶酶谱分析法刘　煜　张嘉宁　朱正美 基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)是一组重要的蛋白水解酶,可以水解细胞外基质中胶原、纤维连接蛋白等多种成分[1],参与了人体内许多生理和病理过程,如骨的重建[2]、肿瘤转移[3]等都与MMPs密切相关。近年来研究发现MMPs与生殖过程关系密切[4,5],如在月经的发生,着床与分娩过程都有一定的MMPs的变化,因而对MMPs的活性及种类的分析有着很重要的意义。目前分析MMPs活性及酶量的方法有多种,其中酶谱法是将非还原性SDS2PAGE电泳分析酶种类与检测酶活性有效结合的一种酶学方法。尤其是具有在电泳中可将组织内与MMPs紧密结合的组织抑制剂(TIMPs)分离,进而表现出酶的活性,从而达到在分离不同MMPs的同时又可直接显示其活性条带一举两得的特点。鉴于MMPs酶谱分析法具有方法灵敏,结果直观,能同时观察酶与酶原种类和活性等优点,且其方法较简便,适于在不同实验室应用。本研究用早孕子宫内膜样品经组织培养后,将其所分泌的MMPs运用酶谱分析法进行鉴别种类和活性分析,对方法的实验原理及条件进行了介绍,并就其优缺点进行讨论。一、材料与方法11材料:丙烯酰胺(Acry),十二烷基磺酸钠(SDS),Triton2X100,PepstatineA,苯甲基磺酰氟(PMSF),N,N2亚甲基丙烯酰胺(Bis),1,10菲洛林(1,10phenanthroline),EDTA,明胶蛋白,DMEM󰃗F12无血清培养基,考马斯亮蓝G250,以上均为Sig2ma公司产品;冰醋酸,甲醇(国产分析纯);72、92×103明胶酶标准品(美国NIH,Dr.Stetler2StevensonWG惠赠)。21子宫内膜组织块培养:子宫内膜用灭菌冷生理盐水冲洗血迹后,剪成2mm2大小,在24孔培养板中加重量约50mg󰃗孔组织块及1ml培养基后,于5%CO2、37℃条件下,培养5小时,收集上清,-20℃冰箱冻存用于酶谱分析[6]。31酶谱法:实验原理:MMPs与SDS结合使MMPs结构发生改变,后经SDS2PAGE电泳,将分子量不同的MMPs以及与MMPs结合的组织抑制剂同时分离,再用Trtion2X100除去SDS,在这一过程中引发了MMPs酶原蛋白体外活化机制,酶原在凝胶内除掉一个约10×103的小肽,转变为有活性的酶。MMPs

在体内常以酶原形式分泌并可被纤溶酶等物质激活[7],活化后的MMPs,在除掉SDS后也可以恢复酶活

性,在酶谱上称之为活性型MMPs,从而与酶原相区别,由于它在体内已具有水解胶原等基质的作用,因而在功能上的意义要大于相应的酶原。经过酶的复性及酶原的活化后,凝胶内已经具有活性的MMPs则可在适宜的条件下将其所在位置的底物明胶蛋白或其它底物蛋白(制凝胶时已均匀掺入其中)水解,然后用考马斯亮蓝G250染色,再用脱色液脱色,结果见凝胶普遍蓝染,而底物被水解处即可见到清晰的透明条带,根据其透明的程度及面积的大小判断其酶活性的高底,该方法还可以通过变换底物,从而用来研究不同种类的MMPs。如用酪蛋白做底物研究基质溶解素等。取上述收集的培养上清50Λl加入10Λl样品缓冲液(含1714%SDS,7%蔗糖)混匀后即可进行上样,然后将含有1mg󰃗ml明胶蛋白的10%的丙烯酰胺凝胶加入V216垂直电泳槽中,按照Laemnli[8]方法进行电泳,结束后将凝胶置于培养皿中,加入215%Triton2X100100ml,振荡,重复洗6次,每次5分钟,再用Tris󰃗HCl缓冲液(50mmol󰃗LTris,pH714)冲洗3次,每次5分钟,之后将凝胶放入反应液中(50mmol󰃗L

Tris,pH714,200mmol󰃗LNaCl,10mmol󰃗LCaCl2

),

37℃培养18小时(该步骤可根据实验要求分别加入1,10phenanthroline1mmol󰃗L,EDTA20mmol󰃗L,Pep2

statineA1mmol󰃗L,PMSF20mmol󰃗L等不同的蛋白酶抑制剂,用以鉴定MMPs存在),然后将凝胶置于011%考马斯亮蓝G2250染色液中染色1小时,最后放入脱色液(5%甲醇,715%冰醋酸)中进行脱色[9]。二、结果11早孕子宫内膜的MMPs酶谱:应用酶谱法从早

作者单位:116027　大连医科大学生化教研室

・111・生殖医学杂志1998年6月第7卷第2期孕内膜培养液中可以明确分离得到5种MMPs,其中92×103的酶(MMP29酶原)和72×103的酶(MMP22酶原)活性较高,占MMPs酶总活性的大部分。66×103的酶(MMP22活性型)活性较低,其余两种酶种类不明(图1)。 21不同的蛋白酶抑制剂对早孕内膜分泌的酶的活性抑制:酶与底物(明胶)作用过程中,加入不同的蛋白酶抑制剂,可见:1,10phenanthroline1mmol󰃗L(MMPs特异性抑制剂)可以完全抑制酶对底物明胶的水解活性,EDTA20mmol󰃗L可以抑制酶的大部分活性,PepstatineA1mmol󰃗LPMSF20mmol󰃗L等其他蛋白酶抑制剂不能抑制酶的活性,上述结果可以提示酶谱中的5种酶均为MMPs(图2)

。

31不同培养时间的早孕内膜的MMPs酶谱变化:

早孕内膜经26小时培养(培养基为R1640),每隔2小时取样进行酶谱分析。结果清晰显示:随培养时间的延长,MMPs活性增加(72×103明胶酶A除外)。提示酶谱的方法十分灵敏并可以反映出酶的量的变化(图3)。

图1　早孕内膜分泌的MMPs酶谱。1:72×10

3,92×103

明胶酶标准品,2～4分别为妊娠39、40、42天的早孕内膜分泌的MMPs

图2　不同蛋白酶抑制剂对早孕内膜分泌的酶活性的抑制。1:早孕内膜MMPs,2:1,10phenanthroline抑制酶的活性,3:EDTA抑制酶的部分活性,4:PepstatineA不能抑制酶的活性,5:PMSF不能抑制酶的活性

图3　经26小时培养早孕内膜的MMPs酶谱 三、讨论基质金属蛋白酶的种类较多且作用广泛,其底物包括大部分的细胞外基质成分,其酶量及活性的分析方法较多,如ELISA[10]、Western2blot[11]、荧光法、放射性同位素法[12]等。我们在应用过程中体会到酶谱法除前述优点外还具有无需特殊的试剂如MMPs的抗体等,并且有酶的标准品则可对酶谱进行较为准确的酶量分析等优点。其不足之处,如不能反映组织抑制剂存在时的体内实际酶活性情况,酶活性准确定量比较困难等。此外,实验中MMPs与SDS的结合及MMPs酶蛋白的复性阶段是实验过程成败的关键,所用SDS的溶解度明显影响它从电泳凝胶中去除的难易度,充分去除与酶蛋白结合的SDS是酶谱法得到清晰结果的保证。此外聚丙烯酰胺凝胶的厚度也明显影响实验结果,凝胶薄,其中的SDS较容易除掉,而且电泳时产热少,这样有利于酶的复性。

・211・生殖医学杂志1998年6月第7卷第2期参考文献1　EmonardH,GrimaudJA.Matrixmetalloproteinases:a

review.CellMolBiol,1990,36:131.2　SakamotoS,SakamotoM.Degradativeprocesscsofcon2

nectivetissueproteinswithspecialemphasisoncol2lagenolysisandboneresorption.MolAspectsMed,1988,10,301.3　MoscatelliDM,RifkinDB.Membraneandmatrixlocal2

izationofproteinases:acommonthemeintumorcellin2vasionandangiogenesis.BiochemBiophysActa,1988,948,67.4　刘　煜,张嘉宁,朱正美1基质金属蛋白酶与生殖的关系1生殖医学杂志,1997,6:2491

5　HulboyDL,RudolphLA,MatrisianLM.Matrixmetal2

loproteinasesasmediatorsofreproductivefunction.Mol.HumReprod,1997,3:27.6　TamakoshiK,KikkawaF,NawaA.Differentpatternof

zymographybetweenhumangynecologicnormalandma2lignanttissues.AmJObstetGynecol,1994,171:478.

7　WoessnerJF,MatrixJR.Metalloproteinasesandtheir

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assemblyoftheheadofbacteriophageT41Nature,1970,

227:680.9　MartelliM,CampanaA,BishofP.Secretionofmatrix

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creaseproMMP21andproMMP23secretionbyhumancil2iarysmoothmusclecells.CurrEyeRes,1996,15:869.11　TeronenO,SaloT,LaitinenJ.Characterizationofinter2

stitialcollagenasesinjawcystwall.EurJOralSci,1995,103:141.12　HansUB.Methodsofenzymaticanalysis.3rded.Vol.5.Weinheim.DeerfieldBeech,Florida.Basel:Verlag

Chemic,1984.239-48.(收稿:1997211217　修回:1998203209)

国家计划生育委员会科学技术研究所、WHO人类生殖研究合作中心招收遗传优生进修生通知

随着分子生物学的发展,遗传优生学已经由经典的描述性科学过渡到实验性科学。我们可以利用分子生物学手段对人类先天缺陷形成的分子机制、遗传性疾病的基因诊断和基因治疗等开展研究,指导优生优育工作,为提高我国人口素质作出贡献。国家计划生育委员会科学技术研究所遗传室承担了多项科研攻关项目,有较强的科研力量。本着科学研究与人才培训的原则,现招收有志于遗传优生项目科学研究的客座研究及进修人员。项目内容如下:(1)致死、致残性遗传病新病种的基因诊断及产前基因诊断研究;(2)非创伤性产前诊断:母血胎儿细胞基因诊断研究;(3