第四章 海洋真菌 一、概况 海洋真菌是一类具有真核结构，能形成孢子，营共生、腐生或寄生生活的海洋生物。 一些来源于海洋的称为专性海洋真菌；另一些来源于陆地或淡水，但能在海洋环境中生长与繁殖者，称为兼性海洋真菌。 许多真菌，具有像藻类那样多种多样的繁殖方式，既有产生无性抱子进行繁殖的，也有产生能运动的有性配子进行有性生殖的。 通常为菌丝状或多细胞，只有酵母菌在发育阶段中有单细胞出现。营养方式除黏菌为摄食外，多为吸收式。  海洋真菌包括海洋酵母菌和海洋霉菌。海洋酵母呈圆形、卵形或椭圆形；内有细胞核、液泡和颗粒体物质，为单细胞真核生物 。  海洋霉菌是生长在营养基质上能形成绒毛状，蜘蛛网状或絮状菌丝体的一类真菌，亦是海洋丝状真菌的通称。 二、分类 海洋真菌种类很少，仅为陆地的1％，总共不超过500种。包括丝状高等海洋真菌209多种，海洋酵母菌类约177种，低等海洋藻状菌类约70种。丝状真菌包括子囊菌类（As－comycetes）、担子菌类（Basidiomycetes）和半知菌类（Deuteromycetes）等。海洋酵母菌也主要归属于上述三类中。藻状菌类大多属于水霉菌目、链壶菌目，以及霜霉菌目等。 三、分布 海洋真菌广泛分布于海洋环境中，从潮间带高潮线或河口到深海，从浅海沙滩 到深海沉积物中都有它们的踪迹。 海洋真菌的分布按海洋从上到下可被分为几个垂直带：①由海面到200m深处为第一带，目前报道的真菌大多分离自这一带；②200 - 2000m为第二带；③2000 - 4000m为第三带；④4000 - 6000m为第四带；⑤6000m以下为第五带。 四、生态习性 大多数海洋真菌依赖栖住某种基物而生活，只有少数真菌不依赖基物而自由生活。根据海洋真菌的栖生习性可划分为如下几种生态类型： 1. 木生真菌 木生真菌是能强烈地分解木材和其他纤维物质、数量最多的一类高等海洋真菌。 由于木质在海岸和深海地区都是很普遍的基质，因此在海洋环境条件下，木生真菌也是丝状高等海洋真菌中分布最广的。 2. 附生藻体真菌 在海洋真菌中，约有1/3的种与藻类有关系，其中以子囊菌类居多。目前大约有几十种子囊菌是海藻的寄生菌，其中可寄生在褐藻和红藻藻体上的各有十几种，但寄生在绿藻上的仅有数种，这可能同大多数绿藻寿命较短有关。子囊菌对藻体的寄生侵染可引起多种藻类病害。 3. 红树林真菌 红树是热带、亚热带潮间带盐泽地的挺水陆生植物。栖生在红树林的海洋真菌多半是腐生菌，其中有子囊菌类20余种，半知菌类约20种，担子菌类很少。 浸在海水中的红树树干、枝条和根部的表皮易被真菌侵入而造成腐烂，而埋在泥中的根部，则不易受真菌侵害；海洋真菌能分解红树叶片。 在红树林植物组织内部也正常地生长着微生物，称为内生菌（endphytes)。内生菌是指生长在健康植物组织或细胞内部、不引起植物出现病症的微生物。海洋植物内生菌是寻找新的化学结构和生物活性物质的主要来源。 4. 海草真菌 海草是生活在沿岸海区底部的有根开花植物。海草真菌数量较少。某些海草能被真菌严重侵染，如网黏菌属真菌引起海草细胞的光合作用组织解体，使北美、欧洲沿岸的大叶藻场大面积衰退，造成了严重的后果。 5. 寄生动物体真菌 此类真菌可寄生在动物外骨骼、壳等处。海洋真菌在分解动物体中的纤维素、甲壳素、蛋白质和碳酸钙等过程中起重要作用。低等海洋真菌是引起海洋鱼类和无脊椎动物病害的重要致病菌。 如研究表明链壶菌（La－genidium sp.）、镰刀菌（Fusarium sp.）是海产对虾真菌病的病原菌；绞纽伤壳菌(Ostracoblabe implexa）是欧洲属牡蛎壳病病原菌；霍氏鱼醉菌（Ichthyophonushoferi）可使多种海产鱼类致病。 五、海洋真菌的分离和培养 海洋真菌的分离需要无菌环境，特别是要避免空气中陆地微生物的污染。因此，真 菌的分离操作要在无菌室或超净台中进行，实验桌面最好用75%乙醇擦过，操作时要靠近酒精灯或煤气喷灯火焰。 1. 样品的采集  样品采集的范围包括海水和海底沉积物、浸泡于海水中的木头及其他纤维物质、浮木、诱饵木片、植物根部、红树林、藻类、海草、含有孢子的海水泡沫、海洋动物等。  对于海水和海泥，可用采样器采集 2. 样品的保存 采集的样品最好立即或尽快进行目的菌的分离，如果没有条件，则要将样品暂时保存于4一8℃的低温环境下。 3. 海洋真菌的分离和培养 ① 培养基成分 a. 人工海水。分离培养基制备所用的水可以是陈海水或人工海水（artificial sea water)。 一般人工海水代替天然海水能够方便实验室条件下对真菌的培养，特别对海洋真菌的生理学研究。 b.通用的分离培养基 葡萄糖l0g，蒸馏水400m1，蛋白胨2g，人工海水600m1（pH为7.5) （或陈海水），酵母膏1g。 用锥形瓶分装后于115℃灭菌25min，冷却待用。如果要制备固体培养基，则加1.5%--2.0%的琼脂注意要加人适当的抗生素及生长抑制剂。 c.其他分离培养基 与陆生真菌分离培养基大致相同，只是用海水来配制。 ② 分离培养基的制备  目前已开发了数百种培养基来进行真菌的分离和保藏。只要稍微改变一下培养基的配方，就能用来进行海洋真菌的分离。  酸性的培养基较适合真菌，但是很多细菌也可以生长。所以在真菌选择性培养基中往往要加入各种抗生素或其他细菌的生长抑制剂。 4. 常用的抗生素和抑制剂 ① 有机酸 0.5%苹果酸或0.1%乳酸均可有效抑制细菌的生长，一般要在培养基灭菌后加人。需要注意的是如果pH过低，有些培养基则不会凝固。 ② 抗生素 主要有以下三大类：链霉素、新霉素和卡那霉素，这3种抗生素主要抑制革兰阴性杆菌的生长，使用浓度从30 - 2666mg/L, 一般用100一200mg/L, 或0.03％（链霉素），以上三种抗生素耐热性差，要在灭菌后培养基温度下降到55℃左右再加人； 青霉素，抑制革兰阳性杆菌和革兰阴性球菌细胞壁的合成，使用浓度为12.5-1500mg/L,灭菌后加人，常与四环素同时使用，需要注意的是青霉素不适合用于高酸性的培养基。 ③ 其它 结晶紫，抑制革兰阳性菌，使用浓度为l0mg/L；亚碲酸钾，抑制革兰阳性菌，使用浓度为100mg/L；以上两者都可以和培养基一起灭菌。 ④ 真菌生长抑制剂 虽然许多海洋真菌在人工培养基上都生长得十分缓慢，但是也有生长得很快的种类，如一些青霉和曲霉。为了抑制这些真菌的过快生长，我们可以在培养基中加入一些生长抑制剂。  Dichloran是2,6一二氯一4一硝基苯胺的商品名称，主要用来抑制青霉和曲霉的快速生长，使用浓度为25mg/L。  邻苯酚(o-phenylphenol)，主要用来抑制污染的木霉（Trichoderma）的快速生长，使用浓度为6mg/L 。  牛胆汁（oxgall），完全抑制腐霉和疫霉的生长，部分抑制其他真菌和细菌的生长，常用浓度为0.5%或1.5%  孟加拉红（Rose Bengal)，抑制细菌和其他真菌（如木霉）的快速生长，但对放线菌无效，使用浓度为30一700mg/L,孟加拉红在有光的情况下对真菌有毒害，所以要将分离培养基放在黑暗中培养；  脱氧胆酸钠（Sodium deoxy-cholate），一种阴离子去污剂，抑制真菌菌落的扩展，但不影响孢子的形成，使用浓度为1g/L。 5. 注意事项 ① 表面消毒 对于从海水中采集到的浮木或活组织，动物等，在分离之前最好进行表面消毒。一般是用无菌吸水纸将样品表面的水分吸干，然后用75％的乙醇擦拭或泡在其中约15min。然后可在解剖镜下观察子座形成的情况，或进行孢子的分离。 ② 富集 有些海水样品中真菌的含量较少，所以要进行浓缩或过滤。方法是用无菌的0.45um孔径的硝酸纤维素滤膜将海水过滤，然后直接将滤膜放在培养基上培养，或将滤膜上的沉淀洗下，悬浮在一定的培养液中，再涂布到培养基上。 ③ 培养温度 由于适应了海水的温度，海洋真菌的生长温度都比较低。所以一般用25℃左右温度来进行海洋真菌的培养。另外，由于许多海洋真菌生长很慢，所以一定要注意避免空气中霉菌的污染。 六、海洋破囊霉属真菌的分离培养  这一类真菌较特殊，有些方面像原生生物。可以从海水、海泥、红树林叶子、海藻及其他海洋植物中分离得到。  分离培养基可由0.1%酵母抽提物、0.1%蛋白陈和70%海水组成，同时需要加进链霉素或其他抗生素。分离纯化时可在培养皿中加进样品和植物种子进行引诱分离。扩大培养时在液体培养基中增加葡萄糖0.5％，培养温度25 ℃ 。 七、海洋真菌的保存 1. 海洋丝状真菌的石蜡油保存法 将已纯化的真菌菌丝或孢子接种到斜面上，进行培养，待长到一定程度后，拧紧盖子，放4℃冰箱短期保存。若要长期保存，则往斜面中加无菌的液体石蜡直至盖过斜面，室温保存。另外，也可尝试超低温保存。 2. 海洋酵母的保存 海洋酵母也可以用以上方法进行短期或长期保存。另外，还可以用低温冷冻法进行保存，方法是用含终浓度为15%甘油的培养基，加人已培养好的酵母细胞，迅速放人-80℃冰箱中保存。 八、海洋真菌的意义 （1）海洋真菌与海洋细菌一样﹐参与海洋有 机物质的分解和无机营养物的再生过程﹐为海洋植物不断提供有效营养﹐在海洋食物链中占有重要位置。特別是在海洋沉积物中的真菌菌丝体和酵母菌体﹐为海洋原生动物﹑底栖动物等提供了饵料的来源。 （2）某些海洋真菌能产生抗菌素和其他生理活性物质﹐在生态和应用方面有重要意义﹐如降解海洋环境中的污染物﹐促进海洋自净等。 （3）利用海洋真菌加工麦麸﹑甘蔗渣﹑ 稻草等﹐制成廉价的微生物碎屑混合物﹐用作水产养殖中的饲料。

第五章 海洋真核微藻

 海洋微藻包括海洋中不能游动的单细胞的和丝状体的真核海藻、微藻鞭毛藻、微浮游藻等。  体积较小(0.2 – 500um），数量巨大，广泛存在于海洋中，是海洋生态系统的初级生产者。 一、海洋真核微藻的特点 由于个体小、比表面积大、代谢活性高、生长繁殖快、倍增时间短（仅1d左右）、易于培养，而可获得大量的藻体，其生物多样性极高，全世界水生微藻的总种类数超过10万种，其中海洋微藻的总种类数可能也多达几万种（目前已被认证的有4 000 -- 5 000种）。 二、海洋微藻的分布  海洋微藻的分布环境与蓝细菌相似，以浮游状态或底栖状态分布于海洋。  有些微藻以内生体的形式存在于海洋动物与巨型海藻组子组织中，很多种类的微藻以共生形式存在于海洋无脊椎动物中，许多无脊椎动物产生的代谢产物也可能与内共生微藻有关。 三、海洋微藻的分离和培养 1. 样品采集  水体中的微藻可直接采集海水，通过过滤（滤膜孔径0.6um）可富集微藻；  对于较大的浮游微藻可用浮游生物网（孔径10um）采集和浓缩，这对于海洋水体中，数目稀少的较大的微藻有用。  水表漂浮的微藻可用无菌的平板将表层海水转人无菌容器中获得。  对于生活在生物或非生物结构表面的微藻，可用无菌小刀将微生物的表面膜刮下，也可将琼脂平板压在微生物定居的表面上。  沉积物中的藻也可采用将沉积物铺于琼脂平板表面的方法或将沉积物悬液涂布于分离平板。  底栖型微藻可用载玻片收集，将载玻片放于水体底积物中一段时间，让附着型微藻定居在上面。  空气中的微藻可用敞开的液体培养基或平板收集。  微藻寄生的较小的植物和动物可潜水获得，浮游动物可用网收集。 ※样品采集后必须在最短时间内进行观察，鉴定和分离，因为有些重要的藻体在几小时后就开始解体，导致样品中藻类多样性下降，仅少数种类存活下来。 2. 培养基 ① 培养基用水  对于海洋微藻来说，从开放海洋表面收集的海水比人工海水的效果好，因为配制海水的盐中有一些污染物。  采集的海水通过活性炭吸附可除去海水中的有毒物质及有毒金属而提高水质。