2011年第10期科学大众·科学教育PopularScience冬虫夏草(Cordyceps)为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordycepssinensis（Berk.）Sacc，寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，是我国名贵的滋补壮阳出口中药，但是，由于天然虫草严格的寄生性及生长环境的特殊，远远不能满足市场的需求。因此，从20世纪70年代起，人类就开始利用现代生物发酵技术培育虫草菌丝体[1]来代替天然虫草。本研究采用从虫草菌丝体发酵液中分离虫草多糖，且用苯酚-硫酸法测定了样品中多糖的含量，结果表明：本方法操作简单，结果准确，重现性好，为进一步的研究开发提供了依据。一、.仪器与试药T6分光光度计(北京普析仪器分析厂)，DGH.9245A电热鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)，AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），EYELASB-1100水浴锅(上海爱郎仪器有限公司)。二、方法与结果1.虫草菌丝体发酵液中多糖的提取取冬虫夏草菌丝体发酵液的干燥粉末，精确称取5g，用80%的乙醇提取以除去单糖、低聚糖等干扰成分，最后用水提取多糖。提取液在50℃经减压浓缩至原体积的1/3，浓缩液中加入3～5倍量的95%乙醇，静置过夜，抽滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤多次，60℃烘干至恒重，即虫草菌丝体多糖。2.虫草菌丝体多糖的测定2.1测定原理。本文采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量。多糖在浓硫酸作用下，先水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，然后和苯酚缩合成有色化合物，用分光光度法测定。2.2储备液的制备。2.2.1葡萄糖标准溶液的制备。精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品100mg，蒸馏水溶解定容与100ml容量瓶。2.2.2苯酚溶液的制备。称取苯酚100g，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g,蒸馏收集172℃馏分。称13.33g馏分水溶解后，置200ml棕色容量瓶中，用水稀释至刻度。2.2.3测定波长的选择。精密移取葡萄糖标准溶液0.60ml置10ml容量瓶中,加水补足2ml,加入苯酚溶液1ml,并迅速加入5ml浓硫酸,摇匀后,放置5min,置沸水浴中加热15min,取出冷却至室温并稀释至刻度；另取2ml蒸馏水,加苯酚与浓硫酸同上操作为参比,从370-520nm每隔5nm测定一次吸光度,以吸光度的最大值选择定波长为490nm。2.2.4标准曲线的绘制。精密吸取葡萄糖标准溶液0.20、0.40、0.60、0.80、0.10ml，分别置于10ml容量瓶中,加水补足2ml,用1.4.2.3法显色后,用490nm处测吸光度(见表1)。求得标准曲线回归方程：A=5.84C+0.0044,r=0.9996。表1标准溶液浓度与吸光度的关系标准液浓度C（mg/ml）吸光度A0.020.1280.040.2330.060.350.080.4690.100.5942.3换算因子测定精密称取60℃干燥至恒重的虫草菌丝体发酵液多糖10mg,置25ml容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,精密吸取2.0ml,用2.2.2.3法显色后,测定吸光度,从回归方程中求得多糖供试液中葡萄糖浓度,计算换算因子f。f=W/（C×D）式中W为多糖的质量(mg),C为多糖供试液中葡萄糖的浓度(mg/ml),D为多糖的稀释因素,测得f=1.76。2.4稳定性和精密度的测定。样品显色后每隔1h测一次吸光度,在0～4h内显色稳定。取样品液重复测定6次。RDS=1.05%。2.5加标回收率测定。5份样品液中加入不同量的葡萄糖标准用2.2.2.3法显色，测定吸光度，测得回收率为98.21%。2.6样品含量的测定。精密吸取样品液1.0ml于10ml容量瓶中,用2.2.2.3法测定吸光度,利用回归方程求得供试品中葡萄糖的浓度,按下式计算样品中多糖的含量。多糖含量=C×D×f/W=262.62mg/g式中C为供试品中葡萄糖的浓度(mg/ml)；D为供试液的稀释因素；f为换算因子；为供试品质量（g）。三、讨论1.本研究用的发酵液中含有单糖、二糖等成分，在选用醇沉条件的过程中，用80%乙醇沉淀3次后，单糖、二糖等干扰成分能够去除最完全，而且对多糖含量不影响。2.苯酚-硫酸比色法测定虫草多糖的原理是多糖在浓硫酸的作用下，先水解为单糖，迅速脱水形成糠醛衍生物，然后与苯酚缩合为有色化合物，在490nm处有特征吸收。本法简单，显色稳定，灵敏度高，重现性好。3.用分光光度计法测定虫草菌丝体中多糖含量的测定,结果准确,操作简便可靠,稳定性良好。4.本实验结果表明,虫草菌丝体中含有一定量的多糖,对其种类和结构尚待进一步研究。参考文献：[1]徐方云.冬虫夏草及发酵虫草菌丝体的临床应用［J］.药品评价,2005,2(4):255[2]刘金荣，江发寿.独尾草多糖的超声提取及含量测定[J].中草药，2002，33（4）：322-323[3]李平，王艳辉，马润宇.碱提山茱萸多糖的理化性质及抗氧化活性研究[J].中草药，2003，34（11）：973-976[4]王东，林力，袁昌鲁等.车前子多糖含量的分析[J].中草药，2002，33（10）：896-897[5]田庚元，冯宇澄，林颍.植物多糖的研究进展[J].中国重要杂志，1995，20（7）：441[6]WeiWS,TanJQ,GuoF,etal.effectofcoriolusvesicolorpolysaccharoseonsuperoxidedismutaseactivitiesinmice[J].ActapharmacolSin,1996,17(2):17[7]陈贵宝，罗梅初，刘实晶.虫草的药理作用研究[J].中草药，1997，28（7）：418-417虫草菌丝体发酵液中多糖的提取和含量测定仇冬梅卢永昌(南京市江宁高级技工学校，江苏省211100；青海民族大学化生院药学系，青海省810007）摘要：目的：建立冬虫夏草菌丝体发酵液中多糖的含量测定。结论：方法简便，准确，重现性好，可用于冬虫草菌丝体发酵液中虫草多糖的提取纯化和含量测定。关键词：冬虫夏草菌丝体发酵液；多糖；分离纯化；含量测定中图分类号：R284文献标识码：A文章编号：1006-3315（2011）10-180-001

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