紫甘薯花青素体外抑制α-糖苷酶活性

孟 文，贺 炜，钟英丽，王 征* （湖南农业大学生物科学与技术学院，湖南 长沙410128） 摘 要：为了研究紫甘薯花青素体外对α-糖苷酶活性的影响，试验采用HPLC和LC-MSn对两种紫甘薯ZA1和JS6中花青素的含量和组分进行了对比分析，结果表明两种紫甘薯花青素含量具有统计学差异，分别为52.44mg/g和39.46mg/g,组分基本一致，不同的是ZA1含甲基花青素，而JS6含天竺葵色素。同时研究了ZA1、JS6和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)三种材料在不同作用时间和温度下对α-糖苷酶活性的影响，结果表明这三种材料对α-糖苷酶活性都有抑制效果，但ZA1的抑制效果最佳，当其量达到600µL、抑制时间15min、抑制温度40℃时对α-糖苷酶活性抑制率可达50%以上。用Lineweaver-Burk双倒数作图其抑制类型，根据曲线可判定为竞争性抑制，抑制常数Ki=5.43×10-2 mmol/L，Vmax=1.71 µmol/L·min。 关键词：紫甘薯；花青素；α-糖苷酶；抑制 The effect of Anthocyanin from sweet potato on α-Glucosidase active MENG Wen，HE Wei，ZHONG Ying-li，WANG Zheng* (College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University , Changsha 410128 , China ) Abstract：In order to investigate the effects of Anthocyanin from Sweet potato on α-Glucosidase activity, the contents and component of Anthocyanins from ZA1 and JS6 were analysised by HPLC and LC-MSn, the results indicated that the contents showed statistical variation between them, and contents were 52.44 mg/g and 39.46 mg/g from ZA1 and JS6 respectively. The Anthocyanins from above Sweet potatoes were almost consistent in components except that the peonidin was detected in ZA1 while pelargonidin was detected in JS6. Simultaneously, the effects of Epigallocatechin gallate(EGCG), Anthocyanins from ZA1 and from JS6 on the α-Glucosidase activty were studied with various time and temprature, and the results revealed that these three materials all had inhibiting effects on α-Glucosidase activty, while Anthocyanins from ZA1 showed that it is the most obviously inhibitor to α-Glucosidase among them. When the contents came to 600 µL, inhibiting time came to 15 min and inhibiting temperature reached 40 ℃, the inhibiting rate to α-Glucosidase activity up to above 50 %. Lineweaver-Burk plot showed that Anthocyanin from ZA1 inhibit α-glucosidase activity with a competitive inhibition, Ki=5.43×10-2 mmol/L, Vmax=1.71 µmol/L·min. Key words：Sweet potato; Anthocyanin; α-Glucosidase activity; inhibition 中图分类号：Q-33 文献标识码： A 文章编号： 糖尿病是一种以高血脂以及代谢紊乱为特征，与胰岛素分泌密切相关的全身性疾病，已成为威胁

人类的第3位“健康杀手”，其中Ⅱ型糖尿病占糖尿病患者90%以上。在Ⅱ型糖尿病早期的治疗中，α-葡

萄糖苷酶抑制剂作为我国糖尿病防治指南推荐的一线药物，其作用机制是通过α-糖苷酶的作用来减少糖

类的降解,延缓糖类的吸收。从而有效地降低糖尿病人餐后血糖浓度峰值,达到控制血糖的目的[1-3]。治

疗Ⅱ型糖尿病的药物根据治疗机制不同主要分为：(1)促胰岛素分泌剂：如磺酰脲类；(2)胰岛素增敏

剂：如屈吉他宗(troglitazone)等噻唑烷衍生物；(3)α-葡萄糖苷酶抑制剂(α-GI)：如阿卡波糖等[4-5]。临床 基金项目：国家自然科学基金（31071531）；湖南省自然科学基金（08JJ6004） 作者简介：孟文（1984-），女，硕士研究生。研究方向为酶与天然产物开发。E-mail： mw84625@126.com 通讯作者：王征（1967-），女，教授，博士，研究方向为酶与天然产物开发。E-mail：wz8918@163.com

用于降糖的药物有以二甲双胍为代表的双胍类药物、以拜糖平为代表的α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物和以

罗格列酮为代表的噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂[6]。西药治疗糖尿病疗效肯定，但长期使用需逐渐加量，

大多具有不同程度的不良反应，且不能有效控制并发症[7]。

近年来，从天然产物中筛选降低血糖的活性成分已经成为了研究热点。文献报道[8-10]，紫甘薯中分

离出来的一种二酰基花青素对α-葡萄糖苷酶的抑制可达到降低血糖的作用。为了开发我国紫甘薯资源，

我们提取了ZA1和JS6两种紫甘薯花青素，并分析了它们的含量及组分，同时研究了ZA1和JS6两种紫甘薯花

青素体外对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫甘薯品种：ZA1和JS6为湖南农业大学甘薯研究基地提供。猪小肠：购于湖南农业大学菜市场。4-

硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG，Sigma公司），对硝基苯酚，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG，

长沙三福生物科技有限公司）,还原型谷胱甘肽。

1.2 仪器与设备

TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Agilent 1100高效液相色谱仪

德国安捷伦公司。

1.3 方法 1.3.1 花青素的制备

根据刘超等[11]的方法改进后制备花青素，改进用AB-8大孔树脂对其吸附，再用70%的乙醇溶液洗

脱大孔树脂，收集洗脱液。将洗脱液用旋转蒸发仪在40℃浓缩后，真空冷冻干燥，备用。得到的ZA1和JS6两种花青素提取物均成红色粉末状。 1.3.2 ZA1和JS6两种花青素定量分析

参照文献[11]的高效液相色谱条件测定花青素含量，最终优化条件在30min内流动相B从90%线性减

少到80％；流速为0.3mL / min；检测波长为530nm；柱温35℃；进样量：20μL。以矢车菊色素为对照品，

得回归方程为Y = 80.635 X + 186.6，R2 = 0.9998。

1.3.3 ZA1和JS6两种花青素质谱分析

采用质谱分析方法对所含花青素种类进行鉴定，质谱条件为：离子源类型为电喷雾ESI离子源，离

子源温度为300℃，电离强度为124V，质量扫描范围为m/z 100～600。

1.3.4 α-糖苷酶的制备

将猪小肠破开，用冷的0.9%的生理盐水充分冲洗，然后用一干净载玻片刮取小肠内表面，将刮取

物约按1：5加入冷的67mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆，匀浆液10000r/min离

心(4℃)30min，上清液存于-20℃[12]。

1.3.5 α-糖苷酶抑制活性的测定[13-14]

根据Tremblay等的方法测定α-糖苷酶活性。取67mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.8)1.7mL，1mg/mL谷胱

甘肽50µL，分别加入酶液800µL，再加入适量抑制剂在37℃保温10min，加入29mmol/L PNPG 200µl，

37℃保温20min，加入0.1mol/L Na2CO3 溶液10mL，终止反应。在400nm的条件下，测定其吸光度。

抑制剂活力单位定义：在37℃，pH值6.8的条件下，降低1个酶活力单位所需要的抑制剂量。抑制百

分率=(加抑制剂后酶活力/未加抑制剂的酶活力)×100%。

1.3.6 抑制剂的动力学试验

抑制剂量对抑制活性的影响：在37℃，反应时间20min，反应体系中酶和底物量不变的情况下，改

变抑制剂量，分别取浓度为0.1mg/mL的抑制剂溶液 0µL、50µL、100µL、200µL、400µL、600µL测定抑

制活力。

反应时间对抑制活性的影响：在反应体系中，加入酶、抑制剂和底物分别于37℃恒温反应5min、

10min、15min、20min、25min、30min测定抑制活力。

反应温度对抑制活性的影响：在反应体系中，加入酶、抑制剂和底物分别于30℃、35℃、40℃、45℃、

50℃，55℃反应后，测定抑制活力。

抑制类型的确定：在37℃，反应时间20min，抑制剂量一定的条件下，分别加入浓度为29mmol/L、

14.5 mmol/L、7.3 mmol/L、3.6 mmol/L 的底物溶液，测定其酶活力。然后改变抑制剂的量，其他条件

不变，分别加入含量为0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、1.0 mg/mL抑制剂溶液, 测定其酶活力。用Lineweaver-Burk

双倒数做图法确定抑制作用的类型[15]。

1.4 数据分析

采用SPSS16.0统计软件对实验结果数据进行显著性分析。p<0.05时，认为存在统计学显著差异。 2 结果与分析 2.1 ZA1和JS6花青素含量 由表1可知，图1和图2分别为ZA1和JS6花青素的HPLC色谱图，由图可知ZA1和JS6花青素在组成成分上基本相同，但是各组分所占百分比却有较大差异。 表1 两种花青素含量 Table 1 Anthocyanin contents from ZA1 and Js6 品种 花青素含量(mg/g)品种 ZA1 52.44±0.23* JS6 39.46±0.31* 注：*表示p<0.05 Note:* indicate p<0.05