江苏农业科学２０１０年第４期　・－——３５５－－——　

谭有将，谢小燕，王群，等．克雷伯脂肪酶产生菌产酶条件优化及其粗酶性质研究［Ｊ］．江苏农业科学，２０１０（４）：３５５—３５７　

克雷伯脂肪酶产生菌产酶条件优化及其粗酶Ｉ生质研究　

谭有将，谢小燕，王群，陈　芳，高剑锋　

（石河子大学生命科学学院，新疆石河子８３２００３）　

摘要：对本实验室分离的１株产脂肪酶克雷伯氏菌Ａ２（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｓｐ．Ａ２）的产酶条件进行优化，并对其粗酶性质　

进行初步的研究，为该酶的进一步开发利用奠定一定基础。该菌的最佳产酶培养基为（ｍ／Ｖ）：蛋白胨１．０％，ＭｇＳＯ　・　

７Ｈ２Ｏ　０．０５％，Ｋ２ＨＰＯ４　１．０％，ＫＨ２ＰＯ４　０．４５％，２．０％的菜籽油。发酵条件：ｐＨ值６．５～７．５，２８℃，２００　ｒ／ｍｉｎ摇床振荡　

培养３　ｄ。酶学性质表明：该酶的最佳催化温度和最适催化ｐＨ值分别为４０℃和ｐＨ值８．０，该酶的热稳定性较差，在　

６０℃保温１　ｈ时丧失５０％的活性。Ｍｇ　，ｃａ“和Ｋ　能刺激该酶的活性，而低浓度的ＥＤＴＡ和ＳＤＳ对该酶有明显的抑　

制作用。　

关键词：克雷伯氏菌；脂肪酶；酶学性质　

中图分类号：Ｑ８１４．９　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２—１３０２（２０１０）０４—０３５５—０３　

脂肪酶（１ｉｐａｓｅ，ＥＣ　３．１．１．３）是一类能水解脂肪的酶类，　能在有机溶剂中催化酯合、酯交换等一系列反应，因而在轻　工、化工、医药、食品等行业具有应用和潜在的应用前景…。　

脂肪酶的来源非常广泛，在动物组织、植物的种子都有报道。　

而微生物中的脂肪酶由于来源广泛，种类繁多，易于分离、纯　化且适于工业化生产而越来越受到了人们的重视　。　。因　

此，寻找和分离能产生新型脂肪酶的微生物菌种成为当前脂　

肪酶研究领域的热点之一，如徐同成等　从南极假丝酵母中　

克隆表达了脂肪酶Ａ，张萌等　在内蒙古锡林浩特地区盐湖　

菌种样品分离获得１株嗜盐脂肪酶高产菌并对其酶学性质做　

了研究。本实验室从山东的油田分离鉴定了１株产脂肪酶的　

克雷伯菌，现就其产酶条件及其酶性质做报道，以丰富脂肪酶　的来源及为该酶的进一步开发利用奠定基础。　

１材料和方法　

１．１　菌种　

克雷伯氏菌Ａ２（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｓｐ．Ａ２）分离自山东东营油田　

附近，由本实验室保存。　

１．２培养基及产酶条件优化　

种子培养基：蛋白胨１０．０　ｇ／Ｌ，酵母膏５．０　ｇ／Ｌ，ＮａＣ１　

１０．０　ｇ／Ｌ。发酵培养基：蛋白胨１０．０　ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ　・７Ｈ　Ｏ　

０．５　ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ　１０　ｇ／Ｌ，ＫＨ　ＰＯ　４．５　ｇ／Ｌ，菜籽油１０　Ｌ，ｐＨ　

值为自然。　

发酵条件：挑选单克隆菌落接种到种子培养基中，３Ｏ　ｑＣ、　

２００　ｒ／ｍｉｎ摇床培养过夜。按１．Ｏ％的接种量接种到５０　ｍＬ的　

发酵培养瓶（２５０　ｍＬ三角瓶）中，３Ｏ　ｏＣ、２００　ｒ／ｍｉｎ摇床培养　

收稿日期：２００９—１１—１６　基金项目：教育部促进与美洲、大洋洲地区科研合作与高层次人才培　养项目（编号：２００６ＪＣ１０）。　作者简介：谭有将（１９８５一），男，广西人，硕士研究生，主要从事生物　

化学与分子生物学。Ｅ—ｍａｉｌ：ｔａｎ￣ｌ１１１＠１６３．ｃｏｍ。　通信作者：高剑锋，男，教授，博士生导师，主要从事生物化工和新能　源的相关研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｉａｎｆｅｎｇｇ＠ｓｈｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。　７２　ｈ。　１．３粗酶制备及其酶活测定　

将发酵好的培养基经４℃、１０　０００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，倒掉　上清液，收集到菌体，用ｐＨ值７．０的ＰＢＳ溶液重悬菌体。重　

悬的菌体在冰上，用功率为３００—４００　Ｗ、间隔为２　ｓ的超声波　

破碎１　ｍｉｎ，即制得粗酶液。用于酶性质研究的粗酶还要进一　

步用冷冻干燥剂冷冻干燥为粉末状，然后溶于一定量的无菌　

去离子水中。　酶活性测定按照文献［３］进行。脂肪酶活性定义为：在　

测定条件下，每１　ｍｉｎ释放出１　Ｎｍｏｌ脂肪酸的酶量定义为１　

个酶活单位（ｕ）。相对酶活是指在实验中所测得的酶活力值　

与最高酶活力值的百分比。　

２结果与分析　

２．１　酶的优化　２．１．１不同碳源对产酶的影响将种子液接种到以葡萄糖、　

蔗糖、可溶性淀粉、橄榄油、大豆油和菜籽油为唯一碳源的发　

酵培养基上培养３　ｄ，观察不同碳源对产酶的影响，结果如表　

１所示。从表１可以看出，以有机碳源为唯一碳源时，脂肪酶　的产量比无机碳源高出许多。其中以大豆油和菜籽油为唯一　

碳源时，酶产量最高。因为菜籽油在新疆较容易获得，所以以　

后采用菜籽油发酵。　

表１不同碳源对产酶的影响　

注：培养基（ｍ／Ｖ）为（ＮＨ４）２ＳＯ４　１．Ｏ％，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０５％　

Ｋ２ＨＰＯ４　１．０％，ＫＨ２ＰＯ４　０．４５％，１．Ｏ％的各种碳源。ｐＨ为自然　

３０℃、２００　ｒ／ｍｉｎ摇床振荡培养３　ｄ。　

２．１．２　不同碳源浓度对产酶的影响　以１．０％的　

（ＮＨ　）　ｓＯ　为唯一氮源，在培养基中添加不同浓度的菜籽　油，培养发酵３　ｄ，

观察它对产酶的影响，结果如图１所示。从　．－——３５６－－——　江苏农业科学２０１０年第４期　

４．０　—３．５　３．０　

Ｏ．５　Ｏ　菜籽油浓度（％）　图ｌ　不同浓度的菜籽油对产酶的影响　

注：培养基（ｍ／Ｖ）为（ＮＨ　）２ＳＯ　１．０％，ＭｇＳＯ４－７Ｈ２０　０．０５％，　

Ｋ　ＨＰＯ　１．０％，ＫＨ２ＰＯ４　０．４５％，不同浓度的菜籽油。ｐＨ值自然，　

３Ｏ℃、２００　ｒ／ｒａｉｎ摇床振荡培养３　ｄ。　

图１可以看出：在较低的菜籽油浓度时，菌体生长缓慢，产酶　

量不高；但是当高浓度的菜籽油浓度时，同样会抑制脂肪酶的　

产量；菜籽油浓度在２．０％时，脂肪酶的产量最高。　

２．１．３　不同氮源对产酶的影响　以２．０％的菜籽油为唯一　碳源，在发酵培养基中分别加入１．０％的（ＮＨ　）　ＳＯ　、　

ＮＨ４ＮＯ　、蛋白胨、酵母粉、玉米粉等不同的氮源，发酵培养　

３　ｄ，观察对产酶的影响。从结果（表２）可以看出，用蛋白胨　

发酵时脂肪酶产量最高。　

表２不同氮源对产酶的影响　

项目　氮源（１．Ｏ％）　

蛋白胨　酵母粉ＮＨ４ＮＯ３（ＮＨ４）２ＳＯ４玉米粉　酶活性（ｕ）　５．２０　４．１０　２．１０　３．００　３．７０　注：培养基（，ｎ／Ｖ）为菜籽油２．０％，ｌ￣ＩｇＳ　・７Ｈ２０　０．０５％，　

Ｋ２ＨＰＯ４　１．Ｏ％，ＫＩｔ２ＰＯ４　０．４５％，１．Ｏ％的各种氮源。ｐＨ自然，３０℃、　２００　ｒ／＇ｍｉｎ摇床振荡培养３　ｄ。　

２．１．４不同氮源浓度对产酶的影响　以２．０％的菜籽油为　

唯一碳源，在培养基中分别添加不同浓度的蛋白胨，发酵培养　

３　ｄ，观察其对产酶的影响，结果如图２所示。从图２可以看　

出，不同浓度的蛋白胨对产酶也有一定的影响，蛋白胨浓度为　

１．Ｏ％时其产酶效果最佳。　

蛋白胨浓度（％）　图２　不同蛋白胨浓度对酶活的影响　

注：培养基（ｍ／Ｖ）为菜籽油２．０％，Ｍｇｓｏ　・７Ｈ　０　０．０５％　

Ｋ　ＨＰ　１．Ｏ％，ＫＩｔ　ＰＯ　０．４５％，不同浓度的蛋白胨。ｐＨ值自然　

３０　、２００　ｒ／ｒａｉｎ摇床振荡培养３　ｄ。　

２．１．５　不同初始ｐＨ值对产酶的影响　在最佳碳源和氮源　

浓度下研究不同初始ｐＨ值对产酶的影响，结果如图３所示。　从图３中可以看出：不同的ｐＨ值对菌体的生长有很大影响，　

同时也影响了脂肪酶的产量；ｐＨ值７．５时，产酶量达到最大，　

为６．２３　Ｕ／ｍＬ。　２．１．６不同温度对产酶的影响温度影响着细菌的分裂繁　７　６　Ｓ　５　

４　蜒３　鞋２　

１　０　４．５　５．５　６．５　７．０　７．５　８．０　８．５　９．５　ｐＨ值　图３：￣Ｎｐｎ值对产酶的影响　

注：培养基（ｍ／Ｖ）为菜籽油２．Ｏ％，Ｍｇｓ　・７Ｈ２Ｏ　０．０５％，　Ｋ２ＨＰＯ　１．０％，ＫＨ：ＰＯ　０．４５％，１　０％的蛋白胨。不同的ｐＨ值下　

３Ｏ℃、２００　ｒ／ｍｉｎ摇床振荡培养３　ｄ。　

ｓ　

藿　

温度（℃）　图４　不同温度对产酶的影响　

注：培养基（ｍ／Ｖ）为菜籽油２．０％，Ｍｇｓｏ　・７Ｈ２０　０．０５％，　

Ｋ　ＨＰＯ　１．Ｏ％，ＫＨ２ＰＯ　０．４５％，１．Ｏ％的蛋白胨。ｐＨ值７．５、不同的　

温度下２００　ｒ／ｍｉｎ摇床振荡培养３　ｄ。　

殖，同时也是影响脂肪酶产量的重要因素。我们测定了不同　

温度下，Ａ２菌株的脂肪酶产量。结果（图４）可以看出，和大　

多数产脂肪酶菌株一样，Ａ２菌株在温度为２８—３０℃之间的　

产脂肪酶含量最高，到达７．２３　Ｕ／ｍＬ。　

２．２粗酶性质的研究　

在最佳发酵条件下发酵３　ｄ，发酵液经４℃离心收集菌　

体。菌体经超声波破碎后，于冷冻（一５０℃）真空干燥机干燥　

后，用无菌的去离子水做适当稀释，此即为用于酶学性质研究　

的粗酶液。　２．２．１　酶的最适作用温度　在不同温度下测定脂肪酶的催　

化活性，结果（图５）可见：脂肪酶的最佳催化温度为４ｏ℃，在　４０—５Ｏ℃之间保留有较高的催化活性。　

一　

一　

艇　逝　簧　靶　

温度（℃）　图５　酶的最佳催化温度　

２．２．２酶的最适作用ｐＨ值将酶置于不同的ｐＨ值（４．０—　

１０．０）下观察不同ｐＨ值条件对酶催化活性的影响。结果（图　

６）可以看出，该脂肪酶对ｐＨ很敏感，在低ｐＨ值条件（４．０—　

７．０）和高ｐＨ值条件（８．５—１０．０）下酶的催化活性都不高，而　

在中度偏碱（７．０～８．０）时酶保有较高的催化活性。

　谭有将等：克雷伯脂肪酶产生菌产酶条件优化及其粗酶性质研究　一３５７一　

，、　、．，　

媳　龌　

ｐＨ值　图６　酶的最佳催化ｐＨ值条件　

２．２．３　酶的热稳定性研究将一定量的酶液置于４０～８０℃　的温度中保温１　ｈ，以未经处理的酶液作为对照，观察温度对　

酶的稳定性的影响（图７）。结果表明该酶的热稳定性较差，　

在６０℃的时就只剩下了５０％的酶活，在８０℃保温１ｈ后该　

酶完全失去活力。　

一　一　塑　嫂　落　莨　１Ｏ０　

８Ｏ　

６０　

４０　

２Ｏ　

Ｏ　

温度（℃）　图７酶的热稳定性研究　

２．２．４各种离子及螯合剂对酶的影响据报道，脂肪酶活性　

的维持需要金属离子，有的脂肪酶在经透析去除离子后，发生　

了不可逆转变性。本研究将冷冻干燥的酶用去离子水溶解　

后，以橄榄油乳化液：去离子水（５：４）为基本的催化底物。　

将各种离子或螯合剂加入到基本催化底物中以研究对酶活性　

的影响，结果（表３）表明Ｍｇ“、ｃａ“和Ｋ　等金属离子对酶　

活性具有刺激作用，其他金属离子不影响该酶的活性，而ＥＤ—　ＴＡ和ＳＤＳ等螯合剂对酶活性具有抑制作用。　

表３　不同离子和螯合剂对酶活性的影响　

催化条件：ｐＩ４值７．５，各种不同的添加剂，温度４Ｏ℃，催化时间　１０　ｍｉｎ。　・　３讨论　

目前报道的大多数细菌脂肪酶多为胞外酶　ｊ，而胞内酶　

的报道在国内外很少见。本实验室２００８年自山东东营油田　

附近分离了１株高产胞内脂肪酶的克雷伯菌Ａ２（ＫｌｅｂｓｉｅＵａ　ｓｐ　Ａ２）。这是我国首次从克雷伯菌属中分离到产脂肪酶的菌　

株，本研究对该菌株的产酶条件进行优化，并对其粗酶性质做　

了初步的探索，以期为该酶的进一步开发利用奠定基础。　

研究发现，Ａ２菌株在以葡萄糖等通常被认为是速效碳源　作为唯一碳源时，菌体生长缓慢，脂肪酶产量也不高。而在以　菜籽油等油脂类作为唯一碳源时，菌体生长迅速，且脂肪酶产　

量相应的也高出约４倍。但是高浓度的油脂会抑制该菌脂肪　

酶的产量，这与前人的报道相同　。该菌在高ｐＨ值条件下　

能很好的生长，但是脂肪酶产量不高，其产酶的最适起始ｐＨ　

值为７．５。　

Ａ２脂肪酶的最适催化温度和ｐＨ值分别为４０℃和８．０，　

该酶具有较差的热稳定性，在６０℃保温１　ｈ后，就只剩下了　５０％的酶活性。Ｍｇ“、Ｃａ“和Ｋ　等金属离子对酶活性具有　

刺激作用，其他金属离子不影响该酶的活性，而ＥＤＴＡ和ＳＤＳ　

等螯合剂对酶活性具有明显的抑制作用。克雷伯菌Ａ２　

（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｓｐ　Ａ２）脂肪酶的发现丰富了脂肪酶种类，为生物化　

学和酶学研究提供了新的材料。　

参考文献：　

［１］Ｓｈａｒｍａ　Ｒ，Ｃｈｉｓｔｉ　Ｙ，Ｂａｎｅ￣ｅｅ　Ｃ　Ｕ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃ．　ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｌｉｐａｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｄｖａｎｃｅｓ，　２００１，１９：６２７—６６２．　［２］胡朝阳，韦晗宁，武波，等．产脂肪酶菌株的筛选及酶学特性研　究［Ｊ］．广西农业生物科学，２００６，２５（３）：２６１—２６８．　［３］何耀强，王炳武，谭天伟．假丝酵母９９—１２５脂肪酶的发酵工艺　研究［Ｊ］．生物工程学报，２００４，２０（６）：９１９—９２１．　［４］张立莹，魏东芝，童望宇．假丝酵母Ｃａｎｄｉｄａ　ｒｕｇｏｓａ产脂肪酶条件　的优化［Ｊ］．生命科学研究，２００３，７（４）：３２０—３２３．　［５］杨永酶，韩望，魏武，等．碱性脂肪酶产生菌的筛选与产酶条　件及酶学性质研究［Ｊ］．四川大学学报：自然科学版，２００３，４０　（５）：９３５—９３８．　［６］徐同成，李霞，李铎，等．南极假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）　脂肪酶Ａ在毕赤酵母中的表达、纯化及性质［Ｊ］．科技通报，　２００９，２５（３）：２５５—２６４．　［７］张萌，张晓梅，许正宏，等．嗜盐脂肪酶产生菌的筛选及其粗酶　性质［Ｊ］．微生物学通报，２００９，３６（１）：１４一ｌ９．　［８］乔红群，徐虹，付闪雷，等．脂肪酶产生菌的筛选及其酶性质　

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