. 人用单克隆抗体制品生产及检定考虑要点
前言 生物制品评价和研究中心（CBER）正在修订1987年的“人用单克隆抗体的生产和检定考虑要点（PTC）”。该最新修订本的目的是向开发单克隆抗体制品的发起人和研究人员提供帮助，包括研究性新药（IND）和产品许可证申请时应提交的资料。
此文件取代了1987年的文件，并反映了在多次国内、国际会议上讨论过的值得重视的经验，这些会议包括： 1．FDA疫苗和相关生物制品咨委会于1990年8月召开的“生物制品潜在逆转录病毒污染”讨论会。 2．由国际生物标准化学会（IABS）发起并于 1990年 11月在伦敦召开的“生物制品安全性的病毒学方面会议”。 3．由FDA、IABS、NIH、国家疫苗规划办公室、HHS和WHO发起，于1991年3月在Bethesda召开的“传代细胞系当前所面临的问题”的国际性会议。 4．由FDA和NIH联合发起，于1992年1月在Bethesda召开的”单克隆抗体的临床前安全性试验工作会议”。
单克隆抗体和其他生物制品一样都有可供参考的法规（21 CFR部分200～299和600～680）。与CBER制定的其他考虑要点一样，单克隆抗体考虑要点亦不试图包容所有问题。当特殊制品产生特殊的未包括在“考虑要点”中的问题时， . 则应根据具体情况进行评估。本文及相应的法规本对生产和生产设施进行讨论，发起人应与治疗药物研究和评审办公室及生产企业许可证发放和产品监督办公室磋商。
某些单克隆抗体可由CDER负责主要审查工作，或由CDRH与CBER联合复审，各中心的管辖权依据1991年10月CBER和CDER及CBER和CDRH的内部协议执行。本考虑要点适合于按此协议联合复审的单克隆抗体。
主档案 在研究性新药申请初始阶段不需要全部完成本文中讨论的所有资料，而应在临床开发阶段，由适当的中心以对话方式指导下，使资料不断完善。在某些情况下，在同一设施内以相同的方法制备及检定的单克隆抗体时，资料应归于单一主档案（Master File）中。一般说来，对提交IND主档案，企业或生产许可证申请中的生产数据、信息及所引用的文献均予保密。
范围 用于活体外净化骨髓去除免疫或肿瘤细胞或与活体外净化骨髓装置相结合使用的单克隆抗体，用于收集细胞（如红细胞生成素干细胞）或纯化其他制品的单克隆抗体应与直接用于病人单克隆抗体的纯度、效力、安全性及无外源病毒污染标准相符合。另外，活体外骨髓处理（如补体）通常与单克隆抗体结合使用的试剂亦应符合同一直接用于患者的单克隆抗体标准。 . 单克隆抗体的组合 CBER认为以有前途的临床前评估及临床理论为基础提出进行的联合单克隆抗体临床试验和许可证申请尚待讨论。目前预期有两种组合单克隆抗体类型：杂合型（cocktails和系列型（panels）。
在此文件中，cocktail定义为以固定比例混合而成的两种或多种单克隆抗体。相关的靶抗原包括位于传染性病原体上的多种抗原及多种肿瘤相关抗原。制品的组合理论应有清楚的临床环境或临床资料为依据。另外，应证明组合单克隆抗体间无干扰作用，并鉴定其协同或增强效应。有必要设定每种成份的剂量，剂量设定应根据临床前或临床资料证明某一剂量是必需量或是上限，以及组合物中单抗的比例而定。
在此文中所用 panelse的定义为直接抗相关抗原（如肿瘤抗原，HLA型抗原）的单克隆抗体系列，根据靶抗原的特性，可将其中一种或多种单抗用于单个患者。这些可按单一产品申请许可证。举例来说，单抗系列可以包括淋巴瘤的抗独特型单克隆抗体，及直接抗不同细菌或病毒血清型的单克隆抗体。必须设定每种成分的剂量。在证明全系列有效性的重要临床试验中，应首先获得系列中各成员某些临床经验资料。
制品的生产和检定 I．单克隆抗体的生产 目前，大多数单克隆抗体是抗体产生细胞与骨髓瘤细胞经化学诱导融合后获得的 . 可无限传代的杂交瘤细胞系生产的。在某些情况下，杂交瘤与其他细胞系的再次融合会产生三重或四重杂交瘤。我们预料将来重组抗体及人抗体会有所增加。一般说来，下面所述的原则可适用于所有杂交瘤及异源杂交瘤产品，不考虑来源的种类。所有的生产程序应符合现行GMP标准。
A．细胞系 应提供下列材料 1亲本（骨髓瘤）细胞系的来源，名称和特征，包括其合成及/或分泌的重链或轻链免疫球蛋白； 2动物种类，品系，特性及免疫细胞的组织来源； 3获得可无限传代细胞系程序的描述，如在建立细胞系时采用； 4 免疫原的鉴定及特性； 5．免疫方案的描述；对于人源单克隆抗体，无论是体外还是体内（如严重联合免疫缺陷（SCID）鼠模型）免疫程序均应描述； 6．所用筛选程序的描述；对于人源单克隆抗体，应描述富集抗原特异性B细胞群所用步骤。 7细胞克隆程序的描述（当细胞由含血清培养液适应无血清培养液时，应重新克隆）； 8建立及运用主细胞库及生产用细胞库所采用种子批系统的描述。
参照文献（1）。 . B．组织培养法制备 应提供下列材料 1组织培养程序的描述，如果制品完全在体外制备或细胞在接种小鼠前经过体外传代； 2．所用培养液的描述，包括合格证明及检定结果（用于杂交瘤增殖的血清应无污染物及外源因子）； 3．防止或控制病毒，细菌，真菌及支原体污染的措施； 4．用于进一步生产的细胞或组织培养上清的合格标准。
C．腹水法制备 1应提供有关接种细胞的资料（见B．1）。 2．动物的管理应符合NIH （有关实验动物的饲养与使用指南》，为保证获得生产单克隆抗体用稳定一致高质量的腹水，应建立起动物健康监控规划，包括检疫程序、前哨动物及内部卫生监测计划（包括支原体筛检）。我们亦建议使用无特定病原体（SPF）小鼠。应确定对前哨小鼠进行血清学检测的频率，通常根据病毒污染情况确定检测频率。
3. 制备腹水的所有记录还应包括下列内容： a．所用动物的种属，性别及年龄； b．动物供应者； c．降植烷用量； d．接种细胞量及浓度； . e．初次免疫、细胞接种及腹水采集的时间； f．腹水采集次数及方法； g．”批”的定义； h．动物垫料、饲料及水； i．同笼动物的数量； 3．各流程的环境条件。
D．纯化 单克隆抗体的纯化工艺应具备下列特征： 1生产技术应能防止引入并可去除污染物；包括动物蛋白及材料、DNA、内毒素、其他热原质、培养液成分，层析柱析出成分及病毒等； 2．纯化前测定病毒污染程度； 3．应包括一个或一个以上已知可去除或灭活逆转录病毒的步骤（见参考文献2及第六章去除病毒验证的讨论）； 4纯化方法去除各种外源因子能力的验证。建议在验证试验中采用多种模拟病毒，包括大和小颗粒病毒，DNA和RNA基因组病毒，以及对化学敏感和有耐受性的类脂包膜和无包膜病毒株。这些试验应在实行最后生产工艺时进行。
Ⅱ．纯化未修饰单克隆抗体的鉴定 单克隆抗体在用于人体试验前，应对其抗体特异性，结构完整性及效力等进行精确而全面的鉴定。单克隆抗体应尽可能无非免疫球蛋白污染物。应以一套适当的合格的内部参比品作为批间比较的标准。此套参比品应为己知结构、特异性及效 . 力，在适当条件下保存，并定期检测其结构完整性。当产品改进时，参比品亦应相应改变，到Ⅲ期临床效力试验开始时应最终确定下来。
A．结构完整性 应联合使用SDS－PAGE、IEF、HPLC或其他适当的理化方法证明纯化抗体未断裂。未聚合，末修饰（如：碳水化合物侧链缺失），应将生产批与内部参比品进行并列比较。
B 特异性 试验应证明单克隆抗体与靶抗原特异结合。一旦抗体的特异性得到鉴定，则应用人的组织进行交叉反应性筛检（见第Ⅵ章）。
1． 直接结合试验应包括阴、阳性抗体及抗原对照。至少应检测一种同型匹配但不相关的（阴性）对照抗体。阴性抗原对照应包括一种化学结构相似，但抗原性无关的复合物（如具有相似的化学性质、大小、电荷及电荷密度）。
2．只要有可能，对蛋白，糖蛋白，脂多糖，或其他含有反应表位的分子进行生化测定，并测定自身的抗原表位，若抗原决定簇为碳水化合物，则应确定糖的组分、连接键及正位异构体构型。
3．若有可能，应利用具有确定结构的抗原制品（如寡搪或肽），采用抑制法或其他技术鉴定抗体的特异性。对于复杂的生物混合物，对直接结合试验所用的被试 . 抗原或抑制剂批应进行标化。应定量测定抗体结合被可溶性抗原或其他抗体抑制。 4．一旦确定某一抗体的特异性，重要的是定量测定抗体的结合活性，可以采用一切可行的方法，如亲和力测定，亲合性测定，免疫反应性测定或联合使用这些方法。目前已有许多已发表的方法适用于抗体结合活性的测定。
C．抗独特型疫苗 l．如果是抗独特型疫苗（Ab2疫苗），应鉴定Ab2免疫原，例如是传统型（Ab2 α）还是抗原模拟型（Ab2 β）（5a)。 2．苦可以获得人 Abl抗体（名义抗原），则应证明 Ab2 β疫苗与适当的Abl群抗体具有反应性。 3．应用远交系及近交系动物对Ab2制品免疫应答（对靶抗原）的适当性进行研究
D．效力试验及标准规格 效力试验可用于鉴定产品，监测批间变异和确保产品的稳定性。可通过结合试验，血清学试验，在动物模型中的活性试验，体内或体外功能试验进行效力测定。最理想的情况是，试验方法与制品公认的生理活性具有最相近的关系，并有足够的敏感性，以检测出制品临床功能差异。由于效力试验用于保证制品批间一致性，因此效力试验应可靠，可重复并敏感。
1．抗体结合活性可用ELISA，RIA，放免沉淀反应，细胞毒性反应，流式血细