北 方 民 族 大 学 实 验 论 文

题 目： 利用ITS序列鉴定真菌 学 院： 生物科学与工程学院 专 业： 生物技术 班 级： 082 姓 名： 李晓飞 李 妍 吾木尔古丽 张瑞莉 陈 波 艾克拜尔 指导老师： 刘建利

完成日期：2011年5月18日——2011年6月5日 分子生物学实验 利用ITS序列鉴定真菌

第1页 共7页 利用ITS序列鉴定真菌 李晓飞 李 妍 吾木尔古丽 张瑞莉 艾克拜尔 陈 波 （北方民族大学 生物科学与工程学院 银川 750021） 摘要：采用实验室提供的两株酵母菌，活化培养后，经基因组DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测，以ITS1和ITS2为引物构成的PCR反应体系对目的DNA片段（ITS1区）进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测后送至测序公司测序，所测序列经Genbank比对后，两株菌分别为掷孢酵母属TY-241菌株(Sporobolomyces sp)和假丝酵母ST-50菌株（Candida sp）。 关键词：ITS序列 酵母菌 PCR 菌种鉴定 1 材料与方法 1.1试验材料与试剂 实验室提供的红色掷孢酵母菌[1]和白色产香酵母菌。 YEPD液体培养基[2]配方：酵母浸粉10g，葡萄糖20g，蛋白胨20g，配成1L溶液，分装100/250ml，121℃灭菌15min。 裂解液[3]：1L裂解液中需加Tris1.2114g，EDTA8.767g，SDS5g，用1M的NaOH调至8.0，121℃灭菌30min备用。 醋酸钾溶液：1L溶液中含醋酸钾245.35g。 氯仿-异戊醇（24：1）：现配现用。 70%乙醇：用95%乙醇配制，现配现用。 10×TAE溶液：1L溶液中含Tris1.2114g，EDTA29.22g，用HCl调pH至8.0。 1%琼脂糖凝胶：取1g琼脂糖溶于100ml1×TAE溶液中，微波炉加热至沸腾三次。 1.2主要仪器与设备 表一 实验中使用的主要仪器 仪器名称 型号 产地 立式自控高压蒸汽灭菌器 LDZX-40SSI 上海申安医疗器械厂 数显恒温水浴锅 HH-4 国华电器有限公司 电泳仪 DYY-12 北京市六一仪器厂 制冰机 AF200PSC50R ΜSA 生物安全柜 HFsafe 1200/C 上海力申科学仪器有限公司 电冰箱 BCD-219D 青岛海尔股份有限公司 Sigma高速离心机 3K30 Germany 电子精密天平 HR-200 上海精科天平 酸度计 DELTA302 上海 电子可调电炉 101RF-3 天津市泰斯特仪器有限公司 双层恒温振荡器 THZ-9511K 太仓市实验设备厂 紫外分析仪 WD-9403C 北京市六一仪器厂 台式常温高速离心机 Centrifuge 5415D Germany 微量移液器 多型号 Germany 生化培养箱 LRH-250 上海一恒科技有限公司 基因扩增仪 Palm-Cyeler Aμstralia 电泳槽 DYCZ-24A 北京六一仪器厂 分子生物学实验 利用ITS序列鉴定真菌 第2页 共7页 1.3实验方法 1.3.1酵母菌的活化及培养 采用本实验楼4楼保藏的红色掷孢酵母菌和白色产香酵母菌[4]，先将菌株接于斜面中，25℃培养24h，再转接入三角瓶中100ml/250ml，25℃培养24h，保存于4℃冰箱备用[5]。 1.3.2酵母菌基因组DNA的提取 DNA的提取按照Makimura等[6]（1994）的方法进行。 ⑴ 用移液器吸取1ml菌液，置于已灭菌的1.5ml的离心管内，常温下12000rpm离心1min，弃上清； ⑵加入250μl裂解液； ⑶100℃水浴15min； ⑷加入250μl 2.5M的醋酸钾后，置于冰上30min至1h； ⑸在4℃下13000rpm离心5min，上清夜移至一新1.5ml离心管内； ⑹加入500μl的氯仿-异戊醇（24：1），剧烈振荡，13000rpm，离心15min，移取上清夜至另一灭菌的1.5ml的离心管内； ⑺重复上一步，直到两相之间没有沉淀，将上清液移至另一灭菌的1.5ml的离心管内； ⑻加入500μl的冷的异丙醇，放置在-20℃静置15min； ⑼13000rpm离心15min； ⑽用1ml70%的乙醇洗涤沉淀； ⑾用1ml70%的乙醇再次洗涤沉淀； ⑿将沉淀置于室温下干燥； ⒀加入50μl已灭菌的ddH2O，在室温下溶解2h； ⒁放于-20℃冷藏备用； 1.3.3酵母菌基因组DNA的检测[7] ⑴制备琼脂糖凝胶：将10×TAE贮存液用蒸馏水稀释成1×TAE电泳缓冲液,待用，按1％称取适量琼脂糖,置于250ml锥形瓶中，加入对应量1×TAE稀释缓冲液，盖上封口膜，以减少水份蒸发，放入微波炉里加热沸腾，取出摇匀，使瓶壁上粘附的琼脂糖全部溶解，反复3次，至琼脂糖全部熔化，放置，待其稍冷却。 ⑵胶板的制备：将制胶槽置于水平支持物上,选择合适厚度和齿数的样品梳，插上梳子。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液数滴，摇匀，小心地倒入制胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后，小心拨出梳子，将胶块取出，置于已加入足量1×TAE电泳缓冲液得电泳槽内。 ⑶加样：取20μlDNA样品与2μl6×加样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中，在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入5μl的100bpDNA ladder。 ⑷电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源，以5V/cm（约100V）电泳，当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。 ⑸成像：戴上一次性手套，在波长为254nm的长波长紫外灯下观察胶块，DNA存在处显示分子生物学实验 利用ITS序列鉴定真菌 第3页 共7页 出肉眼可辨的桔红色荧光条带，用凝胶成像系统照相(本实验中仪器损坏，直接用相机拍照)。 1.3.4 ITS片段的PCR扩增及扩增产物的检测 1.3.4.1 PCR反应体系见下表，于冰浴下进行[8]。 表二 核糖体基因反应体系的组成（25µl体系） 试剂 浓 度 体积(µl) PCR缓冲液(包含TaqDNA 聚合酶、Mg2+和dNTP) 2.5× 10

正向引物 10 µM 0.2 反向引物 10 µM 0.2 模板DNA 10 ng/µl -1 µg/µl 1.0 ddH2O 13.6

1.3.4.2 根据下表的引物和PCR反应条件对目的序列进行扩[9]。 表三 核糖体基因PCR反应所用引物和反应条件 扩增片段 引物(5’-3’) PCR扩增反应条件

ITS1区 ITS1:GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG ITS2:GCTGCGTTCTTCATCGATGC 95℃5min；(94℃45s，52℃1min，72℃30s)×30；72℃8min。

1.3.4.3 PCR扩增产物的检测，采用琼脂糖凝胶电泳系统检测同1.3.3。 1.3.5 ITS片段的测序 将PCR扩增产物邮寄至测序公司，由测序公司完成测序。 1.3.6 BLAST比对、鉴定属、种 登录NCBI主页-点击BLAST-点击Nucleotide-nucleotide BLAST在Search文本框中粘贴检测序列-点击BLAST-点击Format-得到result of BLAST。 2 结果与分析 2.1基因组DNA电泳图 图一 酵母菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图

如上图所示，标号“1”为红色掷孢酵母菌的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；标号“2”为白色产香酵母菌的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；C为对照组，无任何条带；标号“M”为Mark，共有15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500bp等8类DNA片段，根据原图对

1 1 2 2 C C C C M 分子生物学实验 利用ITS序列鉴定真菌 第4页 共7页 比，本次实验只可以检测到15000、10000、7500、5000、3000、1500bp等6类DNA片段。酵母菌的基因组DNA破损片段较小，从图中可以看到，红色掷孢酵母DNA片段小于5000bp，集中于3000bp以下；而白色产香酵母的DNA片段有大于15000bp的，集中区段为5000到1500bp。ITS1片段大小为500bp左右，故这样大小的DNA片段可以满足PCR要求。 2.2PCR产物电泳图 图二 酵母菌ITS1片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

如上图所示，标号“1”为白色产香酵母菌的ITS1片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；标号“2”为红色掷孢酵母菌的ITS1片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；“C”为对照组，物任何条带；标号“M”为Mark，共有1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100bp等11类DNA片段，根据原图对比，本次实验只可以检测到1500、1000、900、800、700、600、500、400bp等8类DNA片段。从图中可以看到，白色产香酵母菌和红色掷孢酵母菌的ITS1片段PCR产物大小均位于500-600bp之间，与预测结果相符，目的条带前端存在干扰小条带，可能为引物二聚体所致。 2.3菌株序列与鉴定结果 2.3.1红色酵母菌鉴定结果 ⑴红色酵母菌ITS1序列：共594bp。 1 tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tagtgaatct aggacgttca atttaacttg aagtccgaac 71 tctcactttc taaccctgtg catttgtttt ggttagtagg attcgtctga acacctcttc atttacaaac 141 acaaagtcta tgaatgtata aagtttataa caaaacaaaa ctttcaacaa cggatctctt ggctctcgca 211 tcgatgaaga acgcagcgaa atgtgataag taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg 281 aacgcatctt gcactccttg gtattccgag gagtatgtct gtttgagtgt catgaattct tcaaccctct 351 cttttcttag tgattggagc ggagtttgga ttctgagtgt tgctcctaac ccgagctcat tcgtaatgta 421 ttagcatcca tatttgagtt tcggattgac ttggcgtaat aagactattc gctgaggaat ctaacttcgg 491 ttagaagccg tgtttgaact aggaagctac taatctagct taagtctact tttagattag acctcaaatc 561 agataggatt acccgctgaa cttaaagcat atca