生长抑素受体亚型2、5在肺腺癌细胞株中的表达以及 奥曲肽对肺腺癌细胞分泌TGF-β1的影响 刘擂，李宝平 （山西医科大学第二附属医院肿瘤生物治疗科，山西 太原 030001） 【摘要】目的 研究A-549肺腺癌细胞株生长抑素受体亚型2、5（SSTR-2、SSTR-5）的表达情况及奥曲肽对A-549肺腺癌细胞株分泌转化生长因子β1（TGF-β1）影响。 方法 采用S-P免疫组织化学的方法，检测A-549细胞株中SSTR-2、SSTR-5的表达情况；采用酶联免疫吸附实验的方法（ELIZA）检测奥曲肽对A-549细胞分泌TGF-β1的作用。结果 在A-549肺腺癌细胞株中，SSTR-2、SSTR-5均呈阳性表达。高浓度奥曲肽可以抑制A-549细胞自分泌的TGF-β1，且呈时间-剂量依赖性。结论 SSTR-2、SSTR-5于A-549肺腺癌细胞皆有表达；奥曲肽可以抑制A-549细胞分泌TGF-β1。 【关键词】 肺癌 A-549 生长抑素受体 奥曲肽 TGF-β1 Expression of 2,5 subtypes of somatostatin receptor in A-549 human lung adenocarcinoma cell line and effect of octreotide on secretion of TGF-β1 LIU Lei,LI Bao-ping Department of Oncology,the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China [Abstract]: Objective To observe the expression of subtypes of somatostatin
receptor(SSTR) and the secretion of transforming growth factor β1 (TGF-β1) and to investigate the effect of octreotide on secretion of TGF-β1 in A-549 human lung adenocarcinoma cell line.Methods Immunohistochemical S-P method was employed to examine the expression of subtypes of somatostatin receptor(SSTR).The effect of octreotide on TGF-β1 secretion was measured by enzymes linked immunosorbant assay(ELIZA).Results SSTR-2 and SSTR-5 was detected in A-549 human lung adenocarcinoma cell line.The secretion of TGF-β1 in A-549 human lung adenocarcinoma cell can be proved.Octreotide do inhibit the secretion of VEGF in a dosedependent and time-dependent manner. Conclusion A-549 cells do express SSTR-2 snd SSTR-5;octreotide is an inhibitor on secretion and production of TGF-β1 in A-549 cell line. Key Words Lung Carcinoma;A-549;Somatostatin receptor;Octreotide;TGF-β1
近来临床实践发现，应用生长抑素类似物及化疗的联合治疗方案，常常对许多恶性肿瘤 用免疫细胞化学的方法检测肺腺癌A-549细胞株中的生长抑素2型受体（SSTR-2）及生长抑素5型受体（SSTR-5）的表达，采用酶联免疫吸附实验（ELIZA）的方法检测生长抑素类似物奥曲肽对肺腺癌A-549细胞株分泌TGF-β1的影响。 1.材料与方法 1.1 研究对象 A-549肺腺癌细胞株 购自武汉博士得生物有限公司 1.2 试剂和仪器 胎牛血清（FBS）购自杭州四季青公司 H-DMEM培养基 购自美国Hyclone公司；1％双抗 (100U／ml青霉素及100μg／ml链霉素)购自美国Hyclone公司；SP免疫组化试剂盒 购自武汉博士德生物有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)；TGF-β ELIZA试剂盒购自上海郎顿公司 ；酶标仪购自美国BioTec公司。 1.3 方法 1.3.1 细胞培养 A-549细胞培养于含1％双抗(100U／m l青霉素和100μg／ml链霉素) 及15%胎牛血清的H-DMEM培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，3d后按1:3比例传代，取对数生长期细胞进行实验。 1.3.2 细胞免疫组织化学 染色步骤按照试剂盒说明书进行操作， 各批染色均设立阳性对照组和阴性对照组。每例随机选取10个高倍视野,计数其中阳性细胞数，进而计算阳性细胞百分比。A-549细胞膜染成棕黄色为阳性信号。 1.3.3 双抗夹心法（ELIZA）测定细胞培养液中TGF-β1的含量。具体方法如下： ① 取对数生长期细胞进行实验，将细胞以5×103的密度接种于96孔板，CO2培养箱中培养48小时，分组实验：Ⅰ空白组（无细胞）Ⅱ对照组（培养细胞是不加入奥曲肽）Ⅲ实验组。分设10-5、10-6、10-7、10 -8mol\L四个浓度。各浓度均设6个附孔，分别在24h、48h、72h时收集上清液置于-20℃冰箱备用。 ② 酶标包被板于室温中平衡30分钟。 ③ 分别设空白孔、标准品孔及待测样品孔。酶标包被板上标准品孔中加入不同浓度标准品50μl，待测样品孔中先加入样品稀释液40μl再加入待测培养液10μl，混匀，37℃温育10分钟。 ④ 洗板5次，每孔加入酶标试剂50μl，37℃温育30分钟。 ⑤ 洗板5次，加入显色剂共100μl，混匀，37℃显色10分钟。 ⑥ 每孔加入终止液50μl，混匀后10分钟内测量450nm各孔OD值。 1.3.4 统计学处理 数据采用均数±标准差(χ±s) 表示，各时间组进行单因素方差分析，相关分析使用Bonferroni、S-N-K法进行。以P<0.05为差异具有统计学意义。数据分析采用SPSS 13统计软件进行。 2. 结果 2.1 细胞免疫组织化学染色结果 结果显示，SSTR-2与SSTR-5染色在A-549细胞表面均有棕黄色颗粒分布，说明在A-549肺腺癌细胞中，SSTR-2与SSTR-5两种生长抑素受体均程阳性表达。 2.2酶联免疫吸附实验结果 2.2.1 TGF-β1标准曲线。ELIZA抗体包被板中加入含有各种浓度的标准品，测量其OD值， 绘制标准曲线。 图1 TGF-β1标准曲线 2.2.2 奥曲肽作用后培养液中TGF-β1含量测定的结果 肺腺癌细胞具有自分泌功能，可以分泌TGF-β获得免疫耐受的能力。细胞培养液中加入奥曲肽作用后，根据奥曲肽浓度的不同，对肺腺癌细胞分泌TGF-β1的影响也有所不同。 与对照组相比， 高浓度的奥曲肽(10-6mol/L～10-5mol/L ) 作用后，培养液中TGF-β1含量减少有统计学意义( P< 0.05 ) ， 低浓度则无明显差异( P> 0.05 )。
表1 奥曲肽对A-549细胞分泌TGF-β1的影响（x±s,n=6） 奥曲肽含量 （mol/L） 培养时间
24h 48h 72h 0 23.04±1.09 36.88±2.36 61.66±2.44
10-5 14.49±1.42* 18.33±1.82* 30.43±3.57*
10-6 16.01±0.77* 22.02±2.28* 37.71±6.46*
10-7 19.38±1.81 31.62±3.01 54.45±2.04
10-8 20.79±2.73 33.04±1.86 57.02±3.35
注：与对照组（奥曲肽含量为0）相比，*为P<0.05。
3.讨论 生长抑素受体属于G蛋白耦联受体家族，共具有7个跨膜区段的糖蛋白，按照发现的顺序，分别命名为SSTR1 ～SSTR5 。许多细胞都表达S S T R， 并且通常表达不止一种亚型。到目前为止，多种体外细胞的实验研究已经发现了生长抑素受体在肿瘤细胞增殖和凋亡中扮演重要角色 , 如SSTR1、SSTR2、SSTR4、SSTR5与细胞周期G1期停止有关,而SSTR2、SSTR3则与细胞凋亡有关[ 5 ]。现阶段用于临床治疗的生长抑素类似物 ( SSTA) ,对SSTR2有高度亲和力 ,对SSTR5的亲和力次之 ,对SSTR3亲和力较弱，对 SSTR1和SSTR4基本没有亲和力[ 6 ]大多数神经内分泌肿瘤可较正常组织表达更多的SSTR，以SSTR-2表达最多[7]。所以表达于肿瘤的生长抑素受体 ,尤其是SSTR2和SSTR5,已经作为恶性肿瘤治疗的靶点而被给予更多的关注。已有研究表明，SSTA抑制肿瘤生长的机制之一，是抑制各种促肿瘤生长的激素和生长因子，如转化生长因子（TGF）、表皮生长因子(EGF) 、血管内皮生长因子（VEGF）等的生成和释放，抑制肿瘤血管的形成及参与免疫调节[8]这对生长抑素类似物用