*基金项目:国家高技术研究与发展计划（863）项目（2001AA214051）和国家自然科学基金项目（30080001）。裴炎:男，1948年生，博导，教授。E-mail:
收稿日期：2002-10-11接受日期:2002-12-21农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2003,11渊3冤院221~226
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昆虫病原真菌致病寄主的机制和基因工程改良*
裴炎方卫国张永军（西南农业大学生物技术研究中心，重庆400716）
摘要：随着大量施用化学农药所造成的环境污染等问题日益突出，真菌杀虫剂的研究和开发受到了广泛的关注。由于存
在击倒昆虫时间较长、对环境条件要求高等缺点，昆虫病原真菌的广泛应用受到限制。因此，有必要弄清昆虫病原真菌致病寄
主过程的遗传学和分子生物学机理，找出控制毒力的主效基因。在此基础上，利用基因工程和细胞工程等技术提高菌株毒力，
创造出更适合市场需要的真菌杀虫剂。文章重点介绍了近年来有关昆虫病原真菌致病机理的研究进展，包括侵染寄主过程中
附着胞的形成、降解昆虫体壁的分子机理和昆虫病原真菌的毒素等。同时，还介绍了昆虫病原真菌的遗传转化方法和基因工程
改良的一些新进展。关键词：昆虫病原真菌；致病机理；菌株改良；基因工程
MechanismofFungalPathogenesisinInsectand
StrainImprovementbyGeneEngineering
PeiYanFangWeiguoZhangYongjun(BiotechnologyResearchCenter，SouthwestAgriculturalUniversity，Chongqing400716，China)
Withtheincreasingofwidelypollutedenvironmentalconcernsandhealthrisksassociatedwiththeuseofsynthetic
chemicalinsecticides,researchanddevelopmentofmycoinsecticidehavebeenpaidmuchattentionto.However,therearesomebarrierstoexploitentomopathogenicfungifurtherbecauseoftheirpoorperformanceinfield.Inordertowidentheacceptanceof
mycoinsecticideproductsinmarket,themolecularbiologybasisoffungalpathogenesisininsectshouldbeelucidatedtoidentifyimportantvirulentgenes,whichcouldbethenusedtoimprovethestrainperformancebygeneticengineering.Inthispaper,molecular
basisofappresoriumformation,cuticledegradingandtheroleoftoxinsinfungalpathogenesisininsectwereintroduced.Meanwhile,thegenetransferringmethodsanditsusageinstrainimprovementofentomopathogenicfungiwerealsosummarized.
entomopathogenicfungi;entomopathogenicity;strainimprovement;geneticengineering
随着大量使用化学合成农药所造成的环境污染和害虫抗药性提高等问题日益突出，生物防治越来
越受到重视[1]。昆虫病原真菌是自然界中昆虫种群数量得以控制的主要因素之一[2]。与其它生防微生
物相比，昆虫病原真菌具有主动侵染、寄主不易产生
抗性和可观的扩散效果等特点，因此，昆虫病原真菌
作为一种潜力巨大的生物防治工具而倍受关注。目
前，用于害虫生物防治的昆虫病原真菌涉及半知菌
亚门（Deuteromycotian）和接合菌亚门（Zygomycotina）的数百个种，其中球孢白僵菌（）、金龟子绿僵菌
（）等10余种应用较广，并有了商业产品[3]。虽然昆虫病原真菌得到了广泛的应用，但仍存在击
倒时间长和防效易受环境影响等缺点。为充分挖掘
昆虫病原真菌的应用潜力，必须阐明它们致病昆虫
的分子机制[4]。近年来，昆虫病原真菌特别是金龟子绿僵菌致病机理方面的研究有了长足的进展。利用
基因工程等手段对昆虫病原真菌进行改造，获得安
全、高效的真菌杀虫菌剂，已成为可能。本文将着重
介绍近年来有关昆虫病原真菌致病分子机理和基因工程改良的重要进展和前景。
1昆虫病原真菌侵染的分子机理
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昆虫体壁可以分为外表皮、前表皮、后表皮和皮脂层
4层。外表皮很薄，主要由蜡质层和鞣化的蛋白质组成。前表皮和后表皮主要有几丁质骨架和填充在其
间的蛋白质组成的坚固的昆虫骨骼。昆虫病原真菌
则通过产生水解酶和机械压力来穿透寄主的体壁。
昆虫病原真菌从分生孢子萌发开始侵染到菌体重新在虫体上产生孢子的过程，可分为如下几个步
骤：孢子粘附在昆虫体壁上；孢子萌发并产生侵染结
构；菌丝穿透昆虫体壁；菌体在昆虫的血腔中生长；
导致昆虫死亡；菌丝在虫体上长出并形成孢子。相对
而言，金龟子绿僵菌穿透昆虫体壁这一步研究得较
为详细。昆虫病原真菌的致病机制，尤其在侵染结构
形成、入侵宿主和毒素介导宿主死亡等方面与一些
植物致病真菌相似。了解这些过程将为选择和改良菌株提供理论依据。1.1附着胞的形成
和许多植物致病真菌一样，昆虫病原真菌的分
生孢子在宿主的体表经常分化出附着胞（appresso-rium）。附着胞的功能就是提供机械压力和分解的
体壁降解酶帮助侵染钉穿透昆虫体壁。在金龟子绿
僵菌、球孢白僵菌等大多昆虫病原真菌中，附着胞的
产生对于建立病原与宿主之间的关系是至关重要的
[5]。
胞内第二信使Ca2+和环腺苷酸（cAMP）参与附着胞形成。这些信号转换路径的一些成分已经从
金龟子绿僵菌中鉴定出来[5]。StLeger等[6]提出，附着胞的形成与Ca2+浓度梯度被破坏从而激活一种
离子通道相关。当附着胞开始形成时，cAMP水平会大幅度地上升。一种依赖cAMP的蛋白质激酶
(PKA)的调节亚基已经从金龟子绿僵菌中鉴定出来，添加PKA抑制剂H8会选择性地抑制附着胞的
形成[6，7]。离体条件下cAMP在附着胞发育中的作用同样在稻瘟病菌中被证实。已经从中克隆出了基因。破坏
这一基因会特异性地阻止附着胞的形成，但对菌丝
生长、产孢和有性生殖没有影响[8]。附着胞的形成可能还有其它的一些可能的信号
传导途径，例如，昆虫病原真菌与植物和动物的病原真菌一样都可能存在促分裂原活化蛋白激酶
（MAPK）途径[9]。另外，在植物病原真菌中，疏水蛋
白对附着胞的形成也有较大影响，MPG1被破坏的
稻瘟病菌菌株的附着胞形成的效率和毒力都降低
[10]。在金龟子绿僵菌中克隆了有疏水蛋白的基
因，但是它的功能有待进一步研究[11]。1.2分解寄主外壳的水解酶
昆虫病原真菌通过机械压力和水解酶的水解作用穿透昆虫体壁。相对昆虫体壁的组成成分，病原真
菌产生的水解酶有几丁质酶、蛋白酶和脂酶等。目
前，对脂酶的作用了解不多，蛋白酶的作用研究得较
为清楚，几丁质酶次之[12]。1.2.1蛋白质降解酶在附着胞和以昆虫体壁为
唯一碳氮源的诱导培养基中有多种蛋白酶的表达，
这些蛋白酶可分为两大类。其一是对底物短肽
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Nz具有活性，包括Pr1（类枯草杆菌蛋白酶）；另一类是对短肽
Ben-Phe-Val-Arg-NA有活性的蛋白酶，包括Pr2（胰
蛋白酶）。Cole等[13]报道的Pr4后来被证明是Pr2的
同工酶。用组织免疫定位法证明，Pr1类蛋白酶是在附
着胞和穿透寄主体壁的早期就有高水平表达，Pr1在侵染2h后大量产生，与昆虫体壁接触后，在24h
内Pr1的表达提高10倍左右，60h后由菌丝附近向周围扩散[14]。同时研究表明，Pr1的表达受碳氮抑
制。在克隆的基因的启动子上有碳调控因子结合位点（5'>(g/c)YggRg<3'）和氮调控因子结合位点
（相隔很近的DNA序列GATA），而且碳调控蛋白基因[15]和氮调控蛋白基因都已克隆[16]。
在金龟子绿僵菌Pr1类蛋白酶至少有4种同工酶[14]，连同已发表的[17]和基因[18]，从金龟子
绿僵菌ME1菌株（即ARSEF2575菌株）克隆的
Pr1同工酶基因还有、和等，在
GenBank登录号分别为AJ251964、AJ293220和AJ416689。对这些Pr1类基因的氨基酸序列进行分
析发现，它们的活性区域都一样，其它部分序列变化
较大。
证明Pr1类蛋白酶在昆虫病原真菌致病寄主过程中起重要的直接证据是对基因的破坏和超
量表达实验。基因被破坏的金龟子绿僵菌毒力有下降现象，由于在这个突变体中同时有Pr1a的同
工酶Pr1b等和一个金属蛋白酶高水平表达，使得毒
力下降不明显[19]。但是，高效表达的金龟子绿僵
菌菌株的毒力明显提高，杀虫时间缩短了25%，作物损失减少了40%。同时证明基因是一个致病
因子，在昆虫血淋巴中高浓度的Pr1a蛋白酶会引起昆虫酚氧化酶的过度表达，导致昆虫中毒死亡[20]。同
时由于在血腔中高水平表达的Pr1降解了寄主的免疫蛋白和脱毒蛋白，降低了寄主的免疫能力，从而使
击倒昆虫的时间缩短[21]。这就使得人们想将用222
PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建 www.fineprint.cn第3期裴炎等:昆虫病原真菌致病寄主的机制和基因工程改良
于植物抗虫育种和将基因导入昆虫病毒中以
提高其杀虫速度[22]。基因序列在不同金龟子绿僵菌菌株中也
有很大变化，Leal等[23]利用PCR-RFLP技术分析了不同来源菌株的基因，发现基因的核苷
酸序列的多态性可以将金龟子绿僵菌分成若干类。Pr1类蛋白酶在其它昆虫病原真菌中也存在，
黄色曲霉（）和蜡蚧轮枝菌（）检测到了Pr1类蛋白酶。在不
同的球孢白僵菌菌株中已克隆了两个Pr1类蛋白酶基因[24]和[25]，氨基酸序列分析发现，
这两个基因的N端序列基本一致，而C端序列变化大，长短不同。的启动子中同样含有碳调控
因子结合位点（5'>(g/c)YggRg<3'）和氮调控因子结合位点（相隔很近的GATA）（方卫国，待发表资
料）。这些基因在相应菌体中的作用是否与Pr1在金龟子绿僵菌中一样，还值得进一步研究。
Pr1降解蛋白质的产物平均长度为5个氨基酸残基的短肽，肽酶进一步水解短肽以提供真菌生长
的营养物质。肽酶包括有氨肽酶、羧肽酶和脯氨基双
肽酶等[13]。1.2.2几丁质酶几丁质占昆虫体壁干重的17%
~50%左右，它是抵御外来入侵的一个主要屏障之
一。用Dimilin处理烟草夜蛾，阻止其几丁质合成，然后用金龟子绿僵菌感染这种昆虫。结果发现，几丁
质合成受阻的幼虫体壁很容易被昆虫病原真菌降解。因此几丁质酶很可能也是昆虫病原真菌一个重
要的毒力因子[13]。几丁质酶也是诱导酶，昆虫病原真
菌在以体壁为唯一碳氮源的培养基和侵染昆虫体壁
的过程中在后期产生，这是因为在蛋白酶作用后露出几丁质，再由几丁质诱导几丁质酶的产生。
在昆虫病原真菌中有多种几丁质酶产生，如外切
几丁质酶和内切几丁质酶。根据等电点分为酸性几丁
质酶和碱性几丁质酶。在绿僵菌中克隆了4个几丁质酶基因，分别是金龟子绿僵菌的[26]和
(AF027497)、黄绿绿僵菌的[27]和Kang等[28]从克隆的金龟子绿僵菌几丁质酶基因。我们从球孢白僵菌
中克隆了2个基因，分别是（AY145440）和
Bbchit2（AY147010，AY147011）。
几丁质酶基因在昆虫病原真菌侵染寄主的过程中的后期表达，它们在侵染过程中与蛋白酶等协同
作用降解昆虫体壁。但是，高效表达几丁质酶
基因的金龟子绿僵菌毒力并未提高[29]。因此，几丁质
酶基因的在昆虫病原真菌致病寄主时的作用到底有多大，还有待进一步研究。1.3毒素的作用
昆虫病原真菌在寄主血腔内主要以原生质体、
类似原生质体和囊胞子等形式存在，这种生长形式
的转换也出现在人类病原真菌（如白色假丝酵母）
和植物病原真菌（如尖孢镰刀菌）中，它一方面有助
于在体血腔中的分散与群集，通过增加表面积获取
更多的营养物质，另一方面由于这类细胞表面的细胞壁多糖很少，可最大限度不激发寄主的免疫反应
[21]。昆虫病原真菌能克服寄主的细胞免疫，不但以无
细胞壁或几乎无细胞壁的类酵母的细胞（yeastlike
cell）生长来逃避寄主的免疫系统，而且还分泌毒素
来主动破坏免疫系统。
大多病原真菌毒素的作用是通过抑制血细胞的扩散，降低有粒细胞的数目和浆细胞的循环来削弱
寄主的细胞免疫，另外一些次生代谢产物破坏寄主的生理活动。因此，毒素与昆虫病原真菌毒力密切相
关。毒素主要有白僵菌素（beauverolides）、环孢素（cyclosporin）和破坏素（destruxin）等3种，其中破
坏素的作用正受到广泛的关注。
破坏素是是由6个氨基酸残基通过酯键首尾相
连形成的环肽，环外加上羟基酸。根据羟基酸的类型
和氨基酸残基甲基化的数目，破坏素可分为19类
[30]。许多破坏素的作用是影响寄主免疫细胞的活动，
它们可能是通过改变细胞的Ca2+平衡和细胞内高
分子蛋白的磷酸化来影响细胞免疫系统。在发生真
菌病的过程中，破坏素影响吞噬细胞的活力，细胞的
附着和扩散以及浆细胞的细胞骨架的形成[21]。破坏素还可以激活鳞翅目昆虫肌肉细胞的Ca2+通道，引
起昆虫痉挛后麻痹而死[31]。有实验证明破坏素可以引起昆虫细胞的程序性死亡，以减弱寄主的免疫能
力[32]。另外一些破坏素影响寄主的生理活动，
DestruxinB是液泡型H+易位ATP酶
（vacuolar-typeH+-translocatingATPase）的抑制剂。这种酶引起浆细胞中液泡酸化，使液泡释放消化酶
消化包裹其中的病原真菌细胞。抑制这种酶的活性
减轻了浆细胞的免疫作用[33]。有一些破坏素可以影
响寄主的蜕皮激素的合成，从而影响昆虫的变态。感
染了金龟子绿僵菌延迟或完全抑制新生4龄的烟草
夜蛾幼虫向5龄转化的进程，幼虫期增长可为病原真菌提供丰富的碳水化合物和游离氨基酸等能量物
质[34]。
2昆虫病原真菌的基因工程改良223
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