1北五味子中五味子甲素等木脂素类成分的积累规律研究王喜军*，窦圣姗，于立河，张宁，孟祥才（黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨150040）[摘要] 目的：考察人工规范化种植五味子果实的（北五味子）中五味子甲素等木脂素类成分的积累规律，确定主产地北五味子药材的最适采收期。
方法：运用高效液相色谱法对不同生长期的北五味子中的五味子甲素、五味子乙素及五味子醇甲的含量进行。
结果：8、9、10月份所采的北五味子中五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲三种成分含量随季节的深入而呈现增长趋势，至10月份三种有效成分含量时间均达到最高。
因此，北五味子应在10月上旬采集。
[关键词]五味子；五味子甲素；五味子乙素；五味子醇甲；采收期STUDIES ON THE ACCUMULATIVE REGULATION OF THE CONTENTS OF LIGNINS IN Schisandru chinensis(Turcz.) Bai l Wang Xi-jun* Dou sheng-shan Yu li-he Zhang ning Meng xiang-cai(Pharmaceutical college of Heilongjiang university of Chinese medicine,Haerbin 150040)[ABSTRACT] :Object: To investigate the accumulative regulation of the contents of shiandin A shiandin B etc in Schisandru chinensis(Turcz.) Bai l and the best harvest time of Schisandru chinensis(Turcz.) Bai l in the main producing area . Method: The contents of shiandin A , shiandrin B and schizandrol A were determined by HPLC. Result: The contents of shiandin A , shiandrin B and schizandrol A were gradual increased in August , September and October , the contents were highest in October . Schisandru chinensis(Turcz.) Bai l should be collected in the first ten days of October.[KEY WORDS] : Schisandru chinensis(Turcz.) Bai l ;Shiandin A ; Shiandin B ; Schizandrol A ; Harvest time北五味子为木兰科（Magnoliaceae）多年生落叶木质藤本植物五味子Schisandru chinensis(Turcz.) Bai l的干燥成熟果实，主要分布于我国东北各省山区，野生资源丰富，具有补肾、益气、生津、固涩等功效，目前广泛地用于慢性肝炎的治疗，取得良好疗效。
近年来，随着五味子需求的增加，五味子的资源在逐渐减少，而且由于掠青现象逐年加重，也导致五味子的品质逐渐退化。
因此，在药材主产区广泛开展了人工规范化种植五味子的工作，为使该项工作更有效地进行，提高人工种植五味子的品质，课题组对人工种植北五味子的最1国家科技攻关计划：项目编号99-929-01-17，项目负责人：王喜军。
*通讯作者：wxj@适采收期进行研究。
五味子的化学成分主要含有挥发油和木脂素成分，且木脂素类成分为五味子中的主要药效物质基础[1],而五味子甲素(shiandin A)、五味子乙素(shiandrin B)、五味子丙素(shiandrin C)、五味子醇甲(schizandrol A)、五味子醇乙(schizandrol B)、五味子脂甲(wuweizi ester A) 等为五味子的主要成分，且五味子甲素、五味子乙素及五味子醇甲为北五味子的主要活性物质。
因此，本文以上述三种木脂素类成分为目标，利用高效液相色谱法对北五味子药效物质基础的季节积累进行研究，从而依其确定北五味子的最适采收期。
1 实验仪器及材料1.1 仪器Waters高效液相色谱仪（Waters 600 Controller，Waters 600 Pump，Waters 996 Photodiode Array Detector）； 80-2型离心机；H66MC型超声震荡仪；电热恒温干燥箱。
1.2 药品及试剂对照品五味子甲素（schizandrin）、五味子乙素（deoxyschizandrin）、五味子醇甲（schizandrol A）由中国生物制品药品检定所提供；甲醇，HPLC级，美国迪马（DIKMA）试剂公司；其余试剂为分析纯。
1.3 五味子药材来源2002年8—10月采自黑龙江省中药材GAP研究中心桃山五味子规范化种植基地的样品,经黑龙江中医药大学生药教研室鉴定为木兰科植物五味子[Schisandra chinensis (Turcz) Baill]。
2 实验方法与结果2.1方法学考察2.1.1对照品溶液的制备精密称取五味子甲素约1.50mg、五味子乙素约3.70mg，五味子醇甲约2.5.00mg，置25ml 容量瓶中，用甲醇溶解，摇匀，并稀释至刻度。
即得（每1ml含五味子甲素 0.06mg，含五味子乙素0.148 mg，含五味子醇甲 0.1mg）。
2.1.2色谱条件流速：1ml/min；检测波长：250nm；柱温：40℃；保护柱：Nova-Pak C18Guard-Pak TM ；色谱柱：Hypersil C18(4.6mm×250mm，5um)；流动相：甲醇-水（50：50 15min80：20）。
在此色谱条件下，五味子甲素、五味子乙素及五味子醇甲和样品中其他组分峰基线分离（见图-1），与其相邻色谱峰的分离度大于1.5；按五味子醇甲峰计算，理论塔板数（N）为2000以上；拖尾因子（T）为1.04。
图-1 五味子样品及标准对照品的色谱图a对照品；b五味子样品2.1.3标准曲线绘制五味子甲素和五味子乙素对照品溶液分别自动进样2、4、6、8、10μl，五味子醇甲对照品溶液自动进样3、6、9、12、15μl，以各对照品色谱峰面积Y与质量X做标准曲线，得五味子甲素的回归方程为Y=4.0871×10-7X+0.0145 (r=0.9998)，线性范围为0.12～0.6ug；测得五味子乙素峰回归方程为Y=6.0220×10-7X+0.0541 (r=0.9998)，线性范围为0.296～1.48ug。
取对照品溶液B分别进样3、6、9、12、15ul，得五味子醇甲回归方程为Y=4.0327×10-7X+0.0455 (r=0.9995)，线性范围为0.3～1.5ug。
2.1.4精密度试验精密吸取对照品溶液各10ul，重复进样五次，测得五味子甲素RSD为0.27%；五味子乙素RSD为1.23%；五味子醇甲RSD为1.86%。
2.1.5稳定性试验取五味子粉末0.3g，处理方法同供试品溶液操作，供试品溶液每隔4h重复进样5次，每次20ul，进行稳定性试验，测得五味子甲素RSD为3.73%；五味子乙素RSD为2.67%；五味子醇甲RSD为2.39%。
以上试验结果表明，供试品在16h内保持稳定。
2.1.6重现性试验取五味子粉末五份，每份约300mg，精密称定，处理方法同供试品溶液操作，取20ul注入液相色谱仪，测得五味子甲素RSD为1.98%；五味子乙素RSD为1.59%；五味子醇甲RSD为1.89%。
2.1.7回收率试验取已知含量的五味子粉末5份，每份0.1500g，精密称定，分别加标准溶液A、B各2.5ml，再加甲醇17.5ml，其余操作同供试品溶液制备。
进样20ul，测得加样回收率，依法重复测定3次，平均回收率五味子甲素为98.60%、五味子乙素为99.25%，RSD分别为2.83%和1.96%；五味子醇甲为99.91%，RSD为3.19%。
2.1.8提取条件考察2.1.8.1提取方法的考察取五味子粉末样品300mg二份，精密称定，一份加甲醇20ml超声提取，操作同供试品溶液制备；另一份加甲醇20ml，加热回流2小时，离心15分钟（3000rpm），以下操作同供试品溶液制备。
分别吸取上述二种供试品20ul 测定，结果见表-1。
表-1 不同提取方法测定结果（%）提取方法五味子醇甲五味子甲素五味子乙素超声提取0.4583 0.0977 0.2563 回流提取0.4393 0.0960 0.2493以上结果表明，超声所用时间短，药材中的有效成分比回流提取完全，故本试验采用超声提取方法进行试验。
2.1.8.2提取时间的考察取五味子样品粉末300mg三份，精密称定，置20ml量瓶中，精密加甲醇20ml，密封，分别超声提取20、30、40分钟，离心15分钟（3000rpm），上清液用0.45μm滤膜及ODS预柱滤过，得供试品溶液。
分别吸取上述三种供试品20ul 测定，结果见表-2。
表-2 不同提取时间测定结果（%）提取时间（min）五味子醇甲五味子甲素五味子乙素20 0.4087 0.0807 0.262030 0.4587 0.0980 0.256340 0.4300 0.0967 0.3280以上结果表明，提取30分钟效果较好。
2.1.8.3提取溶剂用量的考察取五味子粉末300mg三份，精密称定，置50ml量瓶中，精密加甲醇15、20、25ml，密封，以下操作同供试品溶液，分别吸取上述三种供试品20ul 测定。
表-3 提取用量考察表加醇量（ml ） 五味子醇甲 五味子甲素 五味子乙素15 0.3920 0.1037 0.2950 20 0.4250 0.1133 0.2997 25 0.4490 0.1600 0.2980 以上结果表明，加甲醇20和25ml 测定相近，但20ml 的色谱峰形较好。
2.2样品的制备及测定分别取不同采收时间北五味子样品粉末（过3号筛）约300mg ，精密称定，置20ml 量瓶中，精密加甲醇20ml ，密封，超声提取（功率250W ，频率20KH Z ）30分钟，离心15分钟（3000rpm ），上清液用0.45μm 微孔滤膜滤过即为供试品溶液，在拟定的色谱条件下测定，结果（表-4、图-2、图-3）表明，所测的三种木脂素类成分呈现基本相同的随时间变化规律，因此，以总量来衡量其变化规律确定其采收期具有可行性。