(3)质粒的拷贝数:是指每个宿主细胞内质粒 的数量。根据每个宿主细胞中质粒拷贝数的 多少，把质粒分为严紧型复制质粒(拷贝数少， 为1-5个)与松弛型复制质粒(拷贝数多，可达 10-200个拷贝)。因此，作为载体的质粒应该 是松弛型的。
(4)质粒的不相容性(incompatibility,又称 质粒的不亲和性)：两种不同质粒，不能够在 同一个寄主细胞系中稳定共存的现象。(亲缘 关系密切的,野生型和其衍生质粒。)
5 常用质粒克隆载体
Hale Waihona Puke 5.1 pSC101质粒载体
一种严谨型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质 粒载体。平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝；分 子量9.09kb，编码有一个四环素抗性基因 （tetr ）。有HindⅢ 、EcoRⅠ、BamH Ⅰ 、 SalⅠ 、Xho Ⅰ 、PvuⅡ、Sma Ⅰ 7种核酸内切限 制酶。其中在HindⅢ 、 BamH Ⅰ、 SalⅠ 3个位 点克隆外源DNA，都会导致tetr 基因失活。
Plasmid chromosome
ccc
2.质粒的生物学特性
(1)质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地 游离状态,但在一定地条件下又会可逆地整合 到寄主染色体上,随着染色体地复制而复制。
(2)质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后,可 以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿 梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体 在基因工程中应用广泛。
表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿 主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强 启动子；
按工作方式:质粒载体、噬菌体载体、粘粒载 体、人工染色体载体等。
按受体细胞:原核细胞载体和真核细胞载体。
第二节 克隆载体
克隆载体(cloning vector)：是指用于扩增 或保存外源DNA片段而设计的载体。 克隆载体的结构特征
pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切 识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部， 2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位 点插入外源片断可以导致tetr 基因的失活；另外有3种限制酶 在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，
第四章 基因工程载体
§1 概述 §2 克隆载体 §3 大肠杆菌表达载体
第一节 概述
载体（vector）是指将外源DNA或基因携带进入宿 主细胞进行扩增或表达的工具。 按功能:克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内 表达和分泌表达载体。
克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆， 建立DNA和cDNA，其上有复制子即可；
⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷 酸序列。
一、质粒载体
质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成 的克隆载体,主要用于smid )的概念：
独立于染色体外能够进行自我复制的双链DNA分子。 天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、 开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。
(2)插入失活(insertional inactivation)
在质粒pBR322的抗四环素基因上插 入一个外源基因后，导致抗四环素基因 失活，变成只对氨苄青霉素有抗性，这
样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来
筛选是否有外源基因片段插入到载体中， 这种筛选方法称为插入失活。
抗药性标记选择(插入失活法)
是第一个真核生物的克隆载体。
5.2 pBR322
pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已 经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。把 pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达 组件，就可以构建成工作所需的新载体。许多实用的 质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原 型质粒在使用上有优点。
③载体都具有合适的遗传标记基因。 ④载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害
的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其 他生物细胞，尤其是人的细胞。
⑤载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源 基因片段。
⑥载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细 胞内大量扩增。
⑦载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代 而不易丢失。
4.标记基因
标记基因按其用途分为2类： 选择标记基因:用于鉴别目的载体的存在， 将成功转化了载体的宿主挑选出来。 筛选标记基因:用于区别重组质粒与非重组 质粒，可将携带了外源DNA片段的重组质粒 挑选出来。
4.1 选择标记基因
4.2 筛选标记基因
(1)α-互补(α-complementation) 是指β-半乳糖苷酶基因(LacZ)上缺失近操 纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵 基因区段的LacZ基因的突变体之间实现互 补，从而产生具有β-半乳糖苷酶学活性的 蛋白，这种现象就称为α-互补。
3.质粒载体的发展概况
第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利 用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二阶段：增大载体容量(降低载体长度)，建立多 克隆位点区和新的遗传标记基因,如pUC系列载体。 第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的 不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动 子载体，表达型载体及各种探针型载体。
多克隆位点(multiple cloning site)
复制起始点
ori
MCS
pUC Ampr 遗传标记
克隆载体具备的条件
①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞， 或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA 上，随着染色体DNA的复制而同步复制。
②载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶 位点，即多克隆位点。
pBR322的结构来源
pBR322质粒载体的优点：
(1)、具有较小的分子量；
它的分子量为4363bp。意味着可以很容易纯化质粒本身及 其所携带的重组DNA分子。即使添加上6kb的DNA链，重组 的pBR322的大小仍在可操作的范围内(＜10kb)。
(2)、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的 选择记号。