13
(6)传递性：
(7)消除性：
(8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋 白质合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受 宿主细胞蛋白质合成的严格控制。 (9)表现型：
14
3、质: 能自我转移 如：F质粒（性质粒、或F因子） B.非接合型质粒： 不能自我转移 如：R质粒（抗性质粒） 带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获 得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
操纵序列
Z
Y
A
Z： β-半乳糖苷酶
启动序列
Y： 透酶
A：乙酰基转移酶
25
2、阻遏蛋白的负性调节
阻遏基因 DNA
pol
I
P
O
Z
Y
A
mRNA
阻遏蛋白
没有乳糖存在时
26
P
O
Z
Y
X
诱导物
乳糖
P O pol
Z
Y
X
Z： β-半乳糖苷酶
27
乳糖操纵子模型Flash
28
-半乳糖苷酶Xgal显色反应： -半乳糖苷酶能把无色的化合物 Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的 物质5-溴-4-氯靛蓝。 Xgal 半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
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1. 抗菌素选择原理 不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在 含有抗菌素的培养基（选择培养基）中 生长。 当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌 后，受体菌才能生长。 抗性基因
死
抗菌素
活
22
Amp
Tet
插入片段
pBR322
Tet平板
Amp平板
抗药性标志的选择
23
2.蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验）
46
47
48
49
第二 噬菌体载体
一、噬菌体的一般特性
噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）
结构：
蛋白质外壳内包裹 着DNA（双链、单 链、线性、环状 等）。
50
T4 Bacteriophage
51
二、噬菌体的生活周期
分为两种：
1. 溶菌周期：
烈性噬菌体（virulent phage)
15
大肠杆菌接合（conjunction）
16
17
二、组建理想质粒载体必须具备的条件
(一)、质粒拷贝数较高 质粒拷贝数是指生长在标准的培养基条件
下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分
子的数目。
18
根据宿主细胞所含的拷贝数多少， 可将质粒分成：
严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细 胞中仅含有1-2份的拷贝，称这类 质粒为“严紧型”复制控制的质 粒(stringent plasmid)； 高拷贝数的质粒，每个宿主细 胞中可高达10-200份拷贝，这类 质粒被称为“松弛型”复制控制 的质粒(relaxed plasmid)。
52
53
2. 溶原周期：
温和噬菌体（temperate phage)
感染细菌后，将自己的DNA整合 到细菌的染色体DNA中。形成这 一过程称为溶源化
54
55
1.单链噬菌体载体
单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体： M13、f1、fd 噬菌体
M13 噬菌体
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M13载体的构建：
1）克隆区域的选定 ① 基因间隔区（intergenic region, IG区）
pBR322
pBR322
重组体的筛选
... . . . . .
涂布有Tet的培养基
.. .. . .
涂布有Amp的培养基
40
2. pUC18/19：
拷贝数 2000 - 3000/cell 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ’ 用于基因克隆和测序
EcoRI SstI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT 396 452
约100bp的自主复制序列（ARS）。 （真核生物中只有酵母菌有ARS）
70
（4）克隆位点 插入失活选择： SUP4酶失活的酵母 菌落呈红色； 不失活的菌落是白 色。
位于 SUP4 基因内部。
1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段 2）Xgal显色反应，可供直接选择 3）无包装限制，克隆能力大 4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链
子代M13噬菌体中包含的是单链+DNA。
60
61
2.噬菌粒载体（phagemid vectors） 由质粒载体与单链噬菌体载体的复制 起点结合而成的新型载体系列。 MCS lacZ’ lacI 噬菌体ori 质粒ori Ampr
lacZ’
lacZ’
缺陷型大肠杆菌
43
pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理
Plac MCS
pUC18/19
5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖 苷
lacZ’
X-gal
b
a
Br
b-半乳糖苷酶 的a-肽段
Cl O N N Br Cl 44
3.植物Ti质粒载体
1）.
45
-半乳糖苷酶
29
lacZ的肽互补 1）-肽（ lacZ’ ）：
宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶C段
载体：-半乳糖苷酶N端的一段氨基 酸片断
4聚体
N端的11-41aa N端的11-41aa N端的11-41aa N端的11-41aa
C端大部分 C端大部分 C端大部分 C端大部分
lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.
松弛型
19
(二)分子量较小
低分子量的质粒如下优点
•外源DNA容量较大， •容易转化，当质粒大于15kb时，将成为转 化效率的制约因素。 •遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不 易断裂。
20
(三)带有可供选择的标记
常采用的标记是对某种抗生素的抗性，
如氨卞青霉素抗性(Ampr)、卡那霉素 抗性(Kanr)、四环素抗性(Tetr)等， 而且希望各抗性基因内有若干单一的 限制酶切点。
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M13 RF
E.coli lac基因的 HindII片断(lacI、 lacP、lacO、lacZ’）
BsuI不完全消化
各种长度的线性片断
（其中应有只在 IG上切开的线性 全长M13）
连接
M13mp1
JM101宿主
只有在IG区插入lacZ’才能存活并 在Xgal上出现互补的蓝噬菌斑
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（6） M13系列载体的优点
36
( 六) 克隆载体必须安全
37
多克隆位点
polylinker
复制起始点
ori
Amp
遗传标记
基因载体
38
三、常用的质粒载体
重要的大肠杆菌质粒载体
1. pBR322：
松弛型复制 氯霉素可扩增 拷贝数 50 - 100 / cell 用于基因克隆
39
外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r Amp s Tet r
T
T
66
第三 大分子DNA克隆载体
一、酵母人工染色体
（yeast artificial chromosome, YAC)
67
2. 染色体复制和遗传的三个基本组件： （1）DNA复制起始点（ori） （2）着丝粒（centromere，cen）
（3）两个端粒（telomeres，tel）
TEL ORI CEN
（5）容易从宿主细胞中分离纯化。
3
3. 载体的功能及特征
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
4
4.载体的种类
1. 克隆载体（cloning vecto. 表达载体（expression vector）：能使目的 基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体 既有复制子，更要有强启动子； 3. 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以 在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和 表达。
TEL
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3. YAC的组成结构 （1）着丝粒区（CEN）
酵母染色体着丝粒区的保守序列:
由三个区组成 I
A A GTCACGTG
II
78-86bp
III
T TGTTTCTGNTTTCCGAAA
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（2）端粒（TEL）
两个端粒序列Tel。 酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。
（3）复制起点（ORI）
J. Messing证明，IG区存在 M13的复制起点，但可以插入 外源DNA而不影响M13噬菌体的 活力。
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2）加入酶切位点
① 在IG区内加入单一内切酶位点 第一个M13载体：M13mp1： 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’ （-肽序列)。 利用-肽序列中的三个单一酶切位 点（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。
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噬菌粒载体的特点
①分子量小
约3000bp（比M13小）
②克隆能力大
能插入10kb的外源DNA。
③两种复制形式
既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制 起点。
既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制， 又能在噬菌体内进行单链复制。 63
3 PCR产物克隆载体 pCR系列载体
T 载体
Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体。
第四节 基因工程载体
vectors
1
1. 载体 （Vectors） 在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入 受体细胞的DNA分子叫载体。