F.Sanger及A.Maxam和W.Gilbert发明了快速的DNA序列测定技术.1977年第一个全长5387bp的嗜 菌体φX174基因组测定完成 第一个基因工程药物-胰岛素在美国和英国获准使用 第一批转基因家畜(兔,猪和羊)诞生 多莉羊诞生
人类基因组草图绘制完成
基因工程历史中的三个重要事件
1、1972年，美国斯坦福大学的P. Berg博士率先 完成了DNA体外重组试验。（分享1982年诺贝 尔化学奖）
EcoR1 T4DNA连接酶
SV40DNA+λ嗜菌体DNA
重组DNA
2、具有性状功能的基因能否重组？
1973年，美国斯坦福大学的S.Cohen等人成功地进行了另一个 体外DNA重组试验。
R6-5 +pSC101 EcoR1 T4DNA连接酶 重组DNA转入大肠杆菌重组菌
Kanr Tetr
Kanr + Tetr
三、主要步骤与内容：
1、获得目的基因
2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能自我 复制并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。
3、将重组DNA分子转移到适当的宿主细胞中，并与之一起 增殖。
4、从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得重组DNA分子的 宿主细胞克隆。
5、从这些筛选出来的宿主细胞克隆中，提取出已经得到 扩增的目的基因，供进一步分析研究用。
社 2006
第一节 基因工程的发展历史和基本概念 一、基因工程的发展历史
基因工程发展史有关的重要事件
年份
重要事件
1869 1944 1953 1958 1961
1965 1966 1967 1970 1972~1 973 1974 1975~1 977 1982 1985 1997 2000
F.Miescher首次从鲑鱼精子中分离到DNA O.T.Avery等人在肺炎链球菌转化实验中发现遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质 J.D.Watson和H.C.Creck提出了DNA分子结构的双螺旋模型 M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA半保留复制模型 M.W.Nirenberg等人应用合成的mRNA分子[poly(U)]破译出了第一批遗传密码 F.Jacob和J.Monod提出了调节基因表达的操纵子模型 证明细菌的抗药性通常有一类叫”质粒”的额外染色体携带
（2）识别位点即为切割位点；
（3）位点上核苷酸顺序通常呈双重旋转对称结构， 即呈回文结构。
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
切割方式通常有三种：
①在识别顺序两条链对称轴上同时切断磷酸二酯键，形成 齐平末端。如HaeⅢ， PvuII。
6、将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之 在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的 物质。
第二节 基因工程的工具酶
定义：凡在基因工程中应用的酶统称为工具酶。
一、限制酶 (restrict enzymes)
（一）限制与修饰现象 大多数的细菌对于噬菌体的感
染都存在一些功能性障碍，即所 谓的寄主控制的限制(restriction)和 修饰(modification)现象，简称R/M 体系。
M.W.Nirenberg,S.Ochoa,H.G.Khorana共同破译了全部的遗传密码 发现了可将DNA连接起来的DNA连接酶 H.O.Smith等分离到第一种核酸内切限制酶,它可以在特定位点将DNA分子切割开来 以H.Boyer,P.Berg等人为代表的一批美国科学家发展了重组DNA技术,并于己于1972年得到第一 个重组的DNA分子,1973年完成第一个细菌基因的克隆 首次实现了异源真核生物基因在大肠杆菌中的表达
PvuII 37 ℃ 5‘ … G-C-T-C-A-G-OH
பைடு நூலகம்
P-C-T-G-G-A-G … 3’
参考书
1、基因工程原理 吴乃虎 科学出版社 第二版 1998
2、分子克隆实验指南 第二版 J.萨姆布鲁克等 科 学出版社 1992
3、现代生物技术导论 瞿礼嘉等 高等教育出版社 1998
4、现代生物技术概论 何忠效等 北京师范大学出 版社
5、生物制药技术 王旻等 化学工业出版社 2003 6、基因工程 楼士林等 科学出版社 2002 7、生物技术与生物药物 王旻等译 化学工业出版
转移到原核细胞重并实现其功能表达。 3、说明了质粒-大肠杆菌不失为一种成功的基因克隆体
系，可以作为基因克隆的模式系统进行深入研究。
二、基本概念 定义：基因工程是指按照人们的意愿，在体外将
核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构 成遗传物质的新组合，并使之转入到原先没有 这类分子的宿主细胞内，形成能持续稳定繁殖 的新物种。其目的是为人类提供有用产品及服 务。
3、不同物种、尤其是真核 基因能否在原核生物中重 组与表达？ 1974年，S.Cohen与 H.Boyer合作进行了如下 试验，结果表明：动物基 因的确进入到大肠杆菌细 胞，并转录出相应的RNA.
以上试验的重要意义有三点： 1、说明像pSC101这样的质粒分子是可以作为基因克隆的
载体，能够将外源DNA分子导入宿主细胞。 2、说明像非洲爪蟾这样真核动物的基因是可以被成功地
②在识别顺序两条链对称轴上两侧同时从5‘ 端切断磷酸 二酯键，形成5‘ 磷酰基端2~5个核苷酸单链粘性末端。 如EcoRⅠ。
③在识别顺序两条链对称轴上两侧同时从3‘ 端切断磷酸 二酯键，形成3‘羟基端2~5个核苷酸单链粘性末端。入 PstⅠ。
PvuII等产生的平头末端
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
作用：一是保护自身的DNA不受限制， 而是破坏外源DNA使之迅速降解。
（二）限制酶的命名和分类
定义：凡在识别并切割双螺旋DNA分子内特定核苷酸 顺序的酶统称为限制酶。 （1）限制酶命名：
（2）限制酶分类：
根据酶的性质，可分为三类
（三）第Ⅱ型限制酶的作用性质
1、基本特性：
（1）识别位点为4~8个核苷酸序列；