常用抗生素的作用方式及抗性机理
抗生素名称 氨苄青霉素 （Amp） 氯霉素 （Cm） 卡那霉素 （Kan） 链霉素 （Sm） 四环素 （Tet） 作用方式 抗性机理 一种青霉素的衍生物，通过干扰 bla抗性基因编码的一种周质酶，即β-内 细菌胞壁合成之末端反应，而杀 酰胺酶，可特异的切割amp的β-内酰胺 死生长细胞。 环，从而失去杀菌效力。 一种抑菌剂，通过同核糖体50S 亚基的结合作用，干扰细胞蛋白 质的合成，并阻止肽键的形成。 cat抗性基因编码乙酰转移酶，特异地使 氯霉素乙酰化而失活
λ噬菌体载体
结构特点: ①线性双链DNA分子 ②具非必需区(约1/3长度） ③两端具12个核苷酸单链互补粘性末端 ④可在E.coli中大量繁殖 ⑤可克隆15Kb左右的外源DNA
（2）质粒的基本特性
1) 2) 3) 4) 5) 自主复制性 不相容性 可扩增性 可转移性 携带遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传 标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需 的附加性状，包括：抗生素、抗抗生素、抗重金 属、产生细菌毒素等。对DNA重组分子的筛选具有 重要意义。
（3）质粒DNA的转移
质粒自主转移
导入
+
自主转移
+
无DNA转移
donor
H H
H
+
辅助转移
H
+
质粒的辅助转移
H
H
+
Notransfer
质粒的重组转移
R-重组DNA分子
重组

+
DNA 转移
R
+ R
（4）质粒的命名
人工组建的质粒 第一个字母是质粒的英文名字（Plasmid）的第一 个字符p, 用小写。后面有两个字母是大写，代表质 粒的发现者和实验室名称，再后面是质粒的编号。
天然质粒载体 天然载体质粒的第一个字母大写，且质粒符号用括 号括起来。如（ColE1）。
（5）质粒的构建
天然质粒的缺陷 分子量大 拷贝数低 单一酶切位点少 遗传标记不理想 ColE1 和pSC101 是两类天然质粒的代表，人工构建 的质粒大都来自它们。
pSC101:
第一个用于基因克隆的天然质粒。宿主细菌沙门氏 菌，9.1kb，严谨型复制，1-2copy/cell，但只有一 个EcoR I切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。
依据载体的生物来源分为： 病毒载体 非病毒载体 根据载体的用途分为： 克隆载体 表达载体 按照导入的受体生物分为： 大肠杆菌载体 酵母载体 植物载体 动物载体
基因载体必须具备的特征条件： 对受体细胞的可转移性。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或 整合位点。 具有多种单一的核酸酶识别位点。 具有合适的选择标记。 分子量较小，多拷贝。
pUC18/19质粒载体的优点
① 更小的分子量和更高的拷贝数 如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp； 500-700copy/cell ② 适于用组织化学方法检测重组体 X-gal显色、抗菌素双重直接选择 ③ 具有多克隆位点（MCS）区 使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入 ④ 测序方便：pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同， 便于把外源DNA转移到M13载体上测序。
缺陷：分子量大 拷贝数低
ColE1:
宿主细菌大肠杆菌，6.5kb，松弛型复制，10003000 copy/cell。筛选标志是大肠杆菌素E1 （colicin E1）。colicin E1能杀死不含ColE1 质粒 的菌，形成“噬菌斑”。 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。 因此可通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发 突变出抗colicin E1的细胞。 缺陷：筛选标志不理想
大肠杆菌质粒分子结构
（1）质粒的分类
①根据赋予的宿主的遗传性状分： F因子（性因子） R质粒（抗性因子） Col质粒（产大肠菌素因子） ②根据质粒的可转移性可分成两大类： 接合型质粒：天然条件下自发地进行细胞间接合。 非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合。
③根据复制控制类型分类 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多 寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒 1-3 拷贝 松弛型复制控制的质粒 10-200 拷贝 在基因工程中，为提高工程菌表达效率，一般 选用松弛型复制控制的质粒。
质粒的人工构建
（1）选择合适的亲本质粒，缩短长度，切去不必要的片 段，提高导入效率，增加装载量 （2）加入易于检出的选择标记基因 （3）增加或减少合适的酶切位点，便于重组 （4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （5）关于质粒安全性的改造 （6）根据基因工程的特殊要求加工特殊的基因元件 （7）构建过程力求简单
构建方法就是重组，拼接。
常用的选择性标记 Ap (Amp): Ampicillin 氨苄青霉素 Tc (Tet): Tetracyclin 四环素 Cm: Chloromycetin 氯霉素 Kan (Km): Kanamycin 卡那霉素 Sm (Str): Streptomycin 链霉素 R (r): Resistance 抗性 S: Sensistance 敏感性 Lac: Lactose 乳糖操纵子 P: Promotor 启动子 IPTG：异丙基—巯基半乳糖苷（乳糖类似物） X-gal：5’-溴4-氯3-吲哚β-D半乳糖苷 (着色剂)
（二）大肠杆菌载体
大肠杆菌载体主要有： ①质粒载体； ②噬菌体载体； ③柯斯（粘粒）质粒
1. 质粒载体
质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共 价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA），1-200kb以上。 并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界 环境因素不利影响的能力。 自身在细菌细胞中能不断复制繁殖,质粒DNA能从细菌中提 出来，又能再转入细菌，这个过程称转化。转入的质粒 DNA仍能进行复制，这种性能为DNA重组技术提供了重要的 条件，即将一种外源基因与质粒重组后，再转入细菌中去 复制繁殖，使外源基因得以增殖。
2. 噬菌体载体
噬菌体是一类细菌病毒的总称，能高效率高 特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖， 或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的 条件下上述两种状态还会相互转化。 噬菌体上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因 工程的有用载体，因为：
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞； 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。
质粒DNA的转移和复制
5' 3'
3'5'
1）质粒转移的必备条件 ⅰ.转移起点(oriT),它是质粒DNA转移时的复制起点— 顺式 作用（cis-action） ii. 细胞附属物—性纤毛，由蛋白质构成—反式作用 ⅲ.转移过程所需的全部酶类—反式作用
2）质粒转移类型 ⅰ.自我转移（Self-transmissible） ⅱ.辅助转移（Donation）—可转移质粒仅具备oriT， 若无辅助质粒，前者不会发生接合转移。若辅助质 粒可提供所有反式作用的蛋白质，前者便会发生接 合转移。 ⅲ.重组转移（conduction）—若质粒无oriT，该质粒 只有整合到辅助质粒DNA中，重组质粒便可转移。 因此，用于克隆外源DNA的分子克隆载体，只要 具备oriT即可，另外两类功能基因可置于辅助质粒 上，该质粒一般没有oriT，因而可以减少后者进入 另一种细胞的频率。
人工构建的质粒根据其功能及用途分为:
基因扩增的质粒：拷贝数达到每个细胞数千 测序质粒 ：高拷贝数、加装测定顺序所必需的序列 整合质粒： 装有整合促进基因及整合特异序列 穿梭质粒 ：能在两种不同的受体细胞中复制 表达质粒： 外源基因能在受体细胞内的高效表达 探针质粒 ：筛选克隆或寻找基因元件，通常装有一个 可以定量测定其表达的标记基因，如抗性基因。
β-半乳糖苷酶作用于X-gal显色反应
X-gal也是β-半乳糖苷酶的一种底物， β-半乳糖苷酶 能把无色的化合物X-gal分解成半乳糖和一个深蓝色 的物质5-溴-4-氯靛蓝
IPTG诱导的结果：蓝白斑筛选
MCS无插入时，互补，蓝菌斑 MCS有插入时，不互补，白菌斑
通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道 是否有DNA插入。
pUC系统
美国University of California的科学家J. Messing和J. Vieria 在pBR322的基础上改造而成。有pUC7、pUC8、pUC9、 pUC10、pUC11、pUC18、pUC19等。 ① 来自pBR322质粒的 复制起点 ② 氨苄青霉素的抗性 基因 ③ 大肠杆菌β-半乳糖 酶基因的启动子及 其编码的α-肽链基 因（lacZ’） ④ 位于lacZ’基因内的 一段MCS区段（10个 连续的单酶切位点）
EcoRI
pMB9 3.5
pMB8 1.8 松弛
融合 特点：松弛、抗性
PstI HpaI
削减 特点：Tetr 、 Ampr 、松、 小
Tn3 pSF2124 7.4 Ampr Tetr pBR312 6.7
Tn3
EcoRI pBR312 5.4
Apr
Ampr
重排 去Tn3上的BamHI 特点：Tcr 、Apr 、松
pBR322的构建过程
复制起始位点：源于 ColE1衍生质粒pMB1。 Ampr基因：源于 pSF2124质粒转座子 Tn3。 Tetr：源于pSC101质 粒。
pSC101 5.8 严紧
Tetr
pBR322构建谱系
Tetr Tetr pBR322 4.3 松弛 Ampr
转位 特点：松弛、 Tetr 、 Ampr 缺点：体积大
一种杀菌剂，通过同70S核糖体 kan抗性基因编码氨基糖苷磷酸转移酶， 的结合作用，导致mRNA发生错 可对Kan进行修饰，从而阻止同核糖体 读。 之间的相互作用。 一种杀菌剂，通过同核糖体30S 亚基之间的结合作用，导致 mRNA发生错译。 一种抑菌剂，通过同核糖体30S 亚基之间的结合作用，阻止细菌 蛋白质的合成 str抗性基因编码一种特异性酶，可对链 霉素进行修饰，从而抑制其同核糖体30S 亚基的结合 tet抗性基因编码一种特异性蛋白质，可 对细菌的膜结构进行修饰，从而阻止四 环素通过细胞膜从培养基中转运到细胞 内。