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氧化铝：酸性：分离酸性色素、羧酸、氨基酸、以及对 酸稳定的中性化合物。碱性：分离生物碱、胺类、中性化合 物。中性：皆宜。
活性与含水量有关。置于400℃电炉 6 h，放入密闭干燥 器，使用时根据所需活性加水。
选择原则：分离弱极性物质，选用活性强的吸附剂；分 离强极性物质，选用活性较弱的吸附剂。
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2. 吸附等温线：达到平衡时，组分在两相中的浓度关系 曲线（absorption isotherm)。流动相为横标，固定相位纵标。
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直线型：Kad 恒定。 凸型：浓度高时，某些吸附较松弛，在固定相中的浓度 比理论值低。 凹型：情况较少见。组分浓度高时，被吸附剂吸附的组 分分子会通过氢键吸附更多的组分分子，使组分分子在固定 相中的浓度高于理论值，较难于洗脱。
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（二）固定相和流动相 葡聚糖凝胶 Sephadex。葡聚糖经稀盐酸降解，环氧丙烷
交联制成。交联度小网孔隙大，溶胀程度大，机械强度小。 交联度用每千克干胶吸水的重量表示。 商品型号用含水量10倍表示，Sephadex G75含水量
7.5g/g。吸水量< 7.5g/g硬胶，用于高压力，从大分子物质 中除去小分子杂质， >7.5g/g软胶。
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第二节 经典液相柱色谱法
一、吸附柱色谱法 （一）基本原理
1. 吸附作用和吸附平衡：吸附剂具有较大的比表面积， 是一种多孔固体颗粒，表面具有许多吸附点位。组分分子在 吸附点位上与吸附上的流动相分子竞争吸附，直至分子吸附 上的速度与解吸下的速度相等，达到吸附平衡。
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Kad 评价色谱柱对试样组分保留能力的参数， 大说明组分 在固定相中保留作用较强，难洗脱，反之，易洗脱。各组分 的Kad不同，可以实现分离。
常用的有：甲醇、甲酰胺、聚乙二醇、辛烷、硅油和角鲨 烷。载体又称担体，要求惰性、多孔、比表面积大。常用硅 胶、纤维素、多孔硅藻土。
2. 流动相： 要求纯度高、粘度小，不与固定相互溶，使 用前用固定液饱和。对被分离组分，固定相应溶解度较大， 而流动相对组分的溶解度较小。
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三、离子交换色谱法 （一）原理
碱阴离子N+R3X-；弱碱阴离子 –NH2，-NHR。主要性能指标： 交联度：离子交换树脂中交联剂含量，1%～16%。最广泛的 是聚苯乙烯型合成树脂，聚乙烯为原料，二乙烯苯作交联剂。 交联度大，则网孔小，适用于分离小分子量的物质，反之，则 大分子量的物质分离。
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交换容量：每千克干树脂参加交换反应的活性基团数， 以mmol/g表示。粒度：树脂溶胀后能通过筛孔的目数，纯水 用10目～50目，色谱分析用 100目～200目。
钠、淀粉和聚丙烯酸。硅胶G（含煅石膏）、硅胶H(不含 粘合剂）。硅胶HF254、硅胶GF254（F代表含荧光剂， 254nm）；氧化铝G、氧化铝GF254、氧化铝HF254。
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制备：软板，硬板。 活化：室温下自然晾干，烘箱加热，硅胶板105 ℃～ 110℃30min，放入干燥器。 2. 点样：约1%的试样，与展开剂极性相似溶剂溶解， 溶剂为低沸点。毛细管点样，直径2mm～3mm，点距2cm。
2. 流动相：常为缓冲溶液。可通过调节流动相的pH或离 子强度来调整组分的保留值。
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四、尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography) 多孔凝胶填料为固定相，按分子大小分离。水溶液为流
动相的称凝胶过滤色谱，为有机溶液的称凝胶渗透色谱。 （一）原理
凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大于孔穴的不被保 留，体积小于孔穴的按分子的大小从柱中流出。
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2. 流动相 要求：纯度高，粘度小，性质稳定，有一定 的挥发性。选择原则：Snyder溶剂强度表示极性，洗脱能力 越强。“相似相溶”。极性大试样，选用极性较强的流动相， 反之选用极性小的。还可采用混合流动相。
吸附色谱对不同族化合物、同分异构体分离能力强，对 同系物效果较差，不适宜分离强极化合物。
一定粒度的吸附剂均匀的铺在光洁的玻璃或塑料平板 上，进行点样、展开、显色、计算比移值Rf（retardation factor，retention factor) 。
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要求Rf值在0.2～0.8之 间，影响因素较多，难以 重复，有人建议采用相对 比移值：
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（二）固定相与流动相 1. 固定相：同吸附色谱，粒度更细，200目（10μm～
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（二）固定相和流动相 1. 固定相：要求：粒度均匀大小适当，机械强度高，较
大的比表面积，吸附点位大小均匀，不与流动相以及被测组 分发生化学反应，不溶于流动相。极性： 无机氧化物如：硅 胶，氧化铝等；非极性：活性炭。
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硅胶：SiO2·xH2O 分离酸性和中性物质。硅醇基活性基 团，形成氢键而吸附。水合硅胶失活。100℃时表面自由水 可逆的除去，>500 ℃，使硅醇基失去一分子结构水，不可逆 的成为硅氧烷结构，失活。
40μm)，分离效率高于吸附色谱。 2. 流动相：称展开剂（developing solvent)。选择时考虑
组分的极性、吸附剂的极、展开剂的极性。 极性小组分使用活性大吸附剂，极性小展开剂；极性大
组分，用活性小吸附剂，极性大展开剂。难分离化合物用多 元混合展开剂性。
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（三）操作技术 1. 薄板的制备： 类型：软板和硬板。粘合剂为煅石膏、羧甲基纤维素
吸附颗粒5μm，用聚丙烯酸为粘合剂，喷雾制成0.2mm 高效薄层，展开距约3cm～6cm，时间3min～20min。自动 点样器，程序化多次展开，红外线自动烘干，自动改变混合 比，自动喷雾显色。分离容量大，检出限低，ng ～pg级。
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（六）特点与应用 效率比柱色谱高，样品量少，速度快，设备简单，但准
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主要用于分离生物高分子如酶、蛋白质、核酸、多糖等。常 用的凝胶还有琼脂糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、多孔硅胶、 多孔玻璃。
流动相要求：溶解试样、粘度低、浸润。四氢呋喃、甲 苯、二氯乙烷、三氯甲烷、苯、二甲基酰胺、水。
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第三节 平面色谱法
（planar chromatography)
一、薄层色谱法 （一）原理
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2. 定量分析： 目视法：斑点大小及颜色 洗脱法： 薄层扫描法（quantitation by TLC scanning) ：扫描仪测 量斑点，测量照射前后光束强度的变化。灵敏度与准确度都 很高，但仪器价格昂贵，对薄板质量的要求高。
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（五）高效薄层色谱法(high performance thin layer chromatography，HPTLC)
确度不及柱色谱。 二、纸色谱简介 （一）方法原理
含20%～25%水分，其中6%～7%以氢键结合，为固定 相。流动相为与水不混合的有机溶剂。分配色谱。
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（二）操作步骤 1. 滤纸选择：杂质含量低，无荧光，质地均匀，平整无
折痕，纤维松紧适当，一定机械强度。分厚型与薄型，快、 中、慢速型。Rf 小选慢速，反之快速或中速。粘度小的展 开剂时，宜选慢速。
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3. 展开：挥干后，展开。通常使用上行法，软板与水 平50 ～100角，硬板应近垂直放置。Rf 值小用下行法，成份 复杂的，可用2 次展开或双向展开。
展开过程中防止“边缘效应”（edge effect)，即同一组 分，斑点在中部比边缘移动慢。
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4. 显色： 紫外：253.7nm汞弧灯 气熏：I2，Br2 显色剂： （四）定性和定量分析 1. 定性分析： 与文献对 照或相同条件下比对。Rf 值。
离子交换树脂为固定相。为网状结构的高分子化合物，活 性基团由二部分组成，一部分为不可交换的阴离子或阳离子基 团，另一部分为结合上的可交换的H+或OH-离子。试样中各种 离子与交换树脂的亲和力不同，强亲和力的在固定相中保留时 间长，反复的交换过程中产生差速迁移。
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（二）固定相和流动相 1. 固定相：强酸阳离子 –SO3H；弱酸阳离子-COOH。强
谱，1980年产生毛细管色谱。
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二、色谱法分类 1. 流动相和固定相物理状态： 气相色谱，液相色谱，超
临界流体色谱。 2. 操作形式：柱色谱，平面色谱。 3. 分离机制：吸附，分配，离子交换，排阻，亲和。
三、基本原理 流动相携带试样对固定相作相对运动，各组分在固定相
和流动相之间的作用力有微小的差别，不同组分被流动相运 载移动的速率不同，产生差速移动（differential migration)。
2. 点样，展开与显色：与薄层同。展开剂：正丁醇、正 戊醇、苯甲酸、酚。用水饱和，不用腐蚀溶液、高温显色。
3. 定性与定量：同薄层。
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二、分配柱色谱法 固定相极性强时，称正向色谱，反之称反相色谱。
（一）分离原理 被分离组分在互不相溶的固定相和流动相中溶解度不
同，即平衡时不同组分具有不同的分配系数，柱中发生了多 次的分配平衡，产生了差速移动。
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（二）固定相和流动相 1. 固定相： 要求：不溶于流动相，有一定的溶解能力。
第十七章 色谱分析法概论
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第一节 概述
色谱（chromatography)：利用物质在两相中不同作用力对
混合物进行分离分析的方法。
一、色谱法的发展史
1906年Tswett分离色素，1935年出现离子色谱，1941年、
1944年Martin发明分配色谱和纸色谱，1956出现薄层色谱，
1952年Martin发明气相色谱，获诺贝尔奖。1968年产生气相色