二轮筛选
第三轮筛选
目录
第
五
节
疾病相关基因的克隆与鉴定
Cloning and Identification of Disease
Relative Genes
目录
克隆疾病相关基因的策略
（一）功能性克隆(functional cloning) （二）定位克隆(positional cloning) （三）非定位候选基因克隆策略(positionindependent candidate gene approaches) （四）定位候选基因克隆策略(positional candidate gene approaches )
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其他
斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization)
DNA点阵 (DNA array)
DNA芯片技术 (DNA chip)
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三 种 印 迹 技 术 的 比 较
目录
②
①
③
分子杂交实验
目录
放 射 自 显 影 照 片
目录
DNA 点阵
目录 目录
四、PCR的主要用途
（一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定
（五）基因突变分析
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三、几种重要的PCR衍生技术
（一）反转录PCR技术
（二）原位PCR技术
（三）实时PCR技术
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实时PCR技术原理
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第
三
节
核 酸 序 列 分 析
Nucleic Acid Sequence Analysis
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一、转基因技术
转基因技术 采用基因转移技术使目的基因整合入 受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导 入动物子宫，使之发育成个体。 转基因——被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal)
——目的基因的受体动物
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二、核转移技术 核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物 体细胞核全部导入另一个体的去 胞核的受精卵内，使之发育成个 体，即克隆(clone)。
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（二）定位克隆
定义
从一种致病基因的染色体定位出发逐步 缩小范围，最后克隆该基因。
系统的定位克隆工作
① 遗传学分析(确定致病基因染色体定位)
交换分析、连锁不平衡分析
② 分子生物学分析
染色）非定位候选基因克隆策略
由于基因组作图的完成和分子病理学的
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第 七 节 生 物 芯 片 技 术
Biological Chip Technology
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一、基因芯片(gene chip) •DNA芯片(DNA chip)
•cDNA芯片(cDNA chip) 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片
段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位
面积的支持物上 。
目录
目录
蛋白质之间相互作用研究的重要性
蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而 形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主
要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括
DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、
信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间
的相互作用。
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常用蛋白质相互作用的研究技术
酵母双杂交
各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选等等
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一、酵母双杂交技术的基本原理
目录
二、酵母双杂交系统的应用
（一）分析已知蛋白之间的相互作用 （二）对蛋白质功能域的分析 （三）分析未知蛋白相互作用 （四）绘制蛋白质相互作用系统图谱
（五）在药物设计中的应用
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目录
DNA自动测序结果举例
目录 目录
第
四
节
基
因
文
库
Gene包含了某一生物体全部技术 的原理及应用
The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application
目录
第
一
节
分子杂交与印迹技术
Molecular
5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的 含量可以扩大100万倍以上。
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二、PCR体系基本组成成分
模板DNA 特异性引物

耐热DNA聚合酶


dNTPs
Mg2+
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三、PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
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目录
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分 子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起， 只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基 配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双 链(heteroduplex) 。
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二、蛋白质芯片 蛋白质芯片(protein chip) 是将高度密集排列的蛋白分子作为探针 点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样 品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检
测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种
技术。
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第 八 节
蛋白质相互作用研究技术
Research Technology of Interaction of Protein
分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同
的DNA片段，将这些片段经电泳分离。
分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放
射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。
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二、DNA链末端合成终止法
目录
目录
三、DNA自动测序
采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列 分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱 氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经 电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种 激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发 射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并 依此确定DNA碱基的排列顺序。
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复性
RNA
DNA
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（一）印迹技术 （二）探针技术 探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记 其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定 在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核 酸分子存在。
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二、印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。 （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根 预测出候选致病基因。
据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，
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（四）定位候选基因克隆策略
当致病基因的染色体定位确认后， 人们可以利用因特网上的基因网站 所提供基因序列数据，鉴定出候选
致病基因。
目录
第六节
遗传修饰动物模型的建立 及应用
The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model
第 二 节
聚 合 酶 链 反 应
Polymerase Chain Reaction
目录
一、基本工作原理
Template DNA
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5
Primer 1 5 Primer 2
Cycle 1
5 5 5
5
Cycle 2
5 5 5 5
目录
5
5
5 5
Cycle 3
5 5 5 5
目录
（一）功能性克隆 定义 从对一种致病基因的功能的了解出发， 克隆该致病基因。
应用 生化机制已明确、基因表达产物较易得 到部分纯化的遗传性疾病。
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克隆方 complementation assay) 利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。
目录
核酸序列分析的基本原理
化学裂解法 (Maxam-Gillbert法)
DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
目录
一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法)
基本原理
基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个
碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应
强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同
目录
目录
三、基因剔除技术 基因剔除技术 也称基因靶向(gene targeting)灭
活，有目的去除动物体内某种基因 的技术。
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四、基因转移和基因剔除技术在 医学中的应用 建立动物模型
① 单基因决定疾病模型 基因剔除 获得性突变(gain-of-function mutation) ② 多基因决定疾病模型