Film
Concentration
Concentration
与传统的压片法对比ChemStudio系列成像系统在相同曝光时间内能得 到更宽的定量范围和更高的灵敏度
22
化学发光成像的局限
分子量大小非常接近的蛋白（磷酸化蛋白）
特点：分子量非常接近，无法进行剪膜检测 传统操作方法： 先检测第一个蛋白 将第一个目标蛋白的抗体剥离掉（巯基乙醇处理5-6个小时，且会 将第二个目标蛋白洗掉一部分，影响检测结果的准确性） 检测第二个蛋白 方法缺陷：检测步骤繁琐、巯基乙醇气味难以忍受、检测结果不准确
29
Western 检测的方法
化学发光
压片法
灵敏度高，定量范围窄 灵敏度高，定量范围宽 定量准确、多重检测 背景高 背景低、定量准确 定量范围窄，灵敏度低
CCD成像
多色荧光
RGB荧光 NIR荧光
DAB显色
30
最优化方案-两种方法结合使用
化学发光（灵敏度） + 近红外多色荧光
（宽线性范围，多重检测，持久信号）
激光
固定波长 最强 满足 背景太高 不可拓展
透射荧光
支持
不支持
不支持
36
滤光片的选择
37
AJ如何帮助客户如何提高实验效率？
快速半干转印 快速：15min-50min，湿转一般1.5h-过夜 节省缓冲液、冷却循环水腔
高通量湿转模块
可同时转印4块凝胶 通量更高
德国耶拿公司—Western Blot 整体解决方案 样品制备 蛋白定量 聚丙烯酰胺凝胶电泳
13
Western Blot Workflow-Detection
DAB显色
生成有色物质 沉淀在膜上
被检测
DAB显色法检测灵敏度低，不能有效的检测低丰度蛋白，且定量范围只有1.5OD
更灵敏的检测方法：化学发光法
14
化学发光检测的优势
• 定量范围更广 • 高灵敏度（化学发光一般光强很弱）
检测方法：
8
UVP Chemstudio系列超敏化学发光成像
可用于极地丰度蛋白表达的检测
-60度科研冷CCD
4/3英寸超大芯片
Bining功能
高光通透性镜头
宽泛的动态范围
专用化学发光托盘
810万
物理像素
极高的物理像素
化学发光级暗箱
数据可追溯
VisionWorks LS 软件 图像信息可以追踪溯 源，任何修改都可以直接显示，确保分析结果 的可信度
• 底片检测（传统的压片，显影，定影） • CCD摄像头检测
15
Chemiluminescence-Western Blot
传统X光压片检测
16
Chemiluminescence-Western Blot
无需外在激发光源，依靠自身发光，一般要求高灵敏度的冷CCD
17
为什么 CCD技术优于底片成像？
匀浆器ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
垂直电泳、电泳电源
转膜
膜封闭，一/二抗体标记
显影检测
湿法或半干转印 、电源
小型摇床
成像系统
41
Thanks for your Attention
43
蛋白表达整体解决方案
Quality is the Difference!
主要内容 1，成功案例分享 2，蛋白表达客户工作流程及存在的问题 3，AJ 解决方案
德国耶拿公司—Western Blot 整体解决方案 样品制备 蛋白定量 聚丙烯酰胺凝胶电泳
匀浆器
垂直电泳、电泳电源
转膜
膜封闭，一/二抗体标记
显影检测
湿法或半干转印 、电源
小型摇床
成像系统
3
Western 流程

蛋白样品的制备
•SDS-PAGE •转膜 •封闭 •一抗杂交 •二抗杂交 •成像检测
4
蛋白表达客户工作流程及存在的问题 随着科研的深入，实验越来越难做
• 高丰度的蛋白越来越少，低丰度蛋白越来也多 • 多蛋白共同作用的研究越来越多，比如蛋白磷酸化修饰 • 研究向纵深方向开展，不仅要做体外检测，还要做在体实时 检测
分析结果是否使用的是原始数据 原始数据是否被人修改
12
Nature对western blotting数据的要求
电泳胶和印迹 “For quantitative comparisons, appropriate reagents, controls and imaging methods with linear signal ranges should be used.” “对于定量比较实验，应该使用适当的试剂、参比及线性 范围内的成像方法。” --- Nature
底片的动力学线性范围低（1.5 ~ 1.9 个数量级) CCD可进行更精确的浓度比较 CCD无需多次曝光
CCD系统 可提示过饱和反应
过饱和像素警示 底片无法警示过饱和区域------数据失真
CCD 系统无需任何消耗品
无需底片及冲洗试剂 无需冲洗设备及暗室
降低了输出成本 (热敏打印 vs. 底片)
20
化学发光 vs. X光片曝光
X光片曝光 所需材料 线性范围 灵敏度
化学发光
胶片、暗室、显影液、 只需一台成像仪 定影液…… 窄，只有约1.8 O.D. 最灵敏的检测方法 低至fg级 宽，超过4 O.D. 最灵敏的检测方法 低至fg级
21
CCD成像与胶片法对比
Film
CCD
Intensity Intensity
5
蛋白表达客户工作流程及存在的问题
• 蛋白表达的结果与基因表达不匹配 • 不同的学生做出来的结果不一样，结果随机性大，不好重复 • 审稿人对蛋白表达结果有异议，不知道该如何提供证据
6
蛋白表达客户工作流程及存在的问题
• 耗时长，工作效率低
7
原因
仪器灵敏度不够
没有选择正确的western 检测方法 没有按照正确的操作进行试验 没有使用最有效的转印方法
CCD与光学强度具有真正的线性对应关系 底片的反应是非线性的
CCD
CCD Counts
底片
pg. SA-HRP
Densitometric Counts (OD)
18
定量线性范围比较
成像方式 CCD 成像
15s 曝光
3D显示
Film
19
为什么 CCD技术优于底片成像？
CCD具有更宽的动力学线性范围(>4.0 个数量级）
近红外成像更适合western blot成像
NIR
NC膜、PVDF膜在不同激发波长 下的荧光背景 NIR波长下膜的背景极低， 更适合做western blot检测
近红外成像
RGB可见荧光成像
28
近红外荧光相对于RGB荧光背景低，结果灵敏度 更高，准确性更高，图片更漂亮，因此被广泛应用于 western blot 多色荧光成像
表达变化差异>104
23
荧光标记抗体的使用
荧光素
化学发光，二抗由酶标记
荧光，二抗由荧光素标记
24
多色荧光—多重检测
Goat antirabbit
Goat antimouse
Rabbit anti-COX IV
Mouse anti-tubulin
COX IV
AlphaTubulin
COX IV
如何选择合适的western blot检测方法？
Western Blotting数据的可信度问题
Source: “All Data are not created Equal” Editorial by Ushma S. Neill, The Journal of Clinical Investigation Volume 119:424, 2009
斯隆-凯瑟琳癌症中心主任Ushma S. Neill在担任 “临床调查研究杂 志”评审期间曾连续拒绝了四篇本已接受并准备发表的来稿后明 确指出，所有提交的western数据的建立必须是平等的，其中包括：
1. 2. 所采用的检测方法定量范围是否可靠？ 实验者如何确定化学发光的曝光时间？
3.
4. 5.
是否有内参？内参是否可靠？
Alpha-Tubulin
25
分子量接近的多蛋白检测对比
凝胶制备
化学发光法
多色荧光法
电泳
电泳
抗体杂交
需要将第一个目的蛋 白的抗体剥离掉，然 后再进行第二个目的 蛋白的抗体杂交检测
成像检测
~5h
目的蛋白抗体剥离 26
磷酸化蛋白检测
化学发光法 无法准确区分和定量目的蛋白
多色荧光法检测 两个目的蛋白分开检测，再后续合并成一张图片 27 不同蛋白之间无干扰 准确区分和定量目的蛋白
LED光源：
波长固定不可改变，光强弱，无法进行小动物成像，无法提供透射光源
激光光源：
波长固定不可改变，光强太强，易造成荧光淬灭，背景高，无法同时提供 顶置和透射光源
35
荧光光源介绍 氙灯/卤素灯
光谱范围 光强 Western成像 小动物成像 应用拓展 全光谱 强 满足 最优 灵活拓展
LED
固定波长 弱 满足 不支持 不可拓展
最优搭配
31
UVP Chemstudio全能成像
超敏化学发光 多色荧光 近红外多色荧光
在体实时检测的解决办法—活体成像
33
在体实时检测
动物成像
植物成像
34
荧光光源介绍
氙灯光源：
可以为成像系统提供从紫外到近红外的全光谱激发光， 即可作为顶置光源，亦可作为透射光源，无限扩展了仪 器的荧光成像应用。 氙灯光源提供更强的激发光，提高检测灵敏度。 应用举例：RGB/NIR多色荧光成像、2D DIGE、小动物 活体成像和植物成像。