三、哺乳动物细胞表达系统不足 之处
哺乳动物细胞在培养条件等方面要求
使用传代细胞可能存在潜在的致癌因子
等不安全因素
白质 在酵母细胞中的表达
一、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)表达系 统
真菌界的单细胞真核生物，有16个染色体。它的全基因组 已在1996年测定。
第三节 重组蛋白质的表达
重组蛋白质在大肠杆菌中的表达
重组蛋白质在哺乳类动物细胞中的表达
重组蛋白质在酵母细胞中的表达
表达载体的一般特点
(1) (2) (3) (4) (5) (6) 复制起始点 选择性基因 强的、可诱导的启动子 强的转录终止序列 核糖体结合位点 合适的多克隆位点
重组蛋白质 在大肠杆菌中的表达
盐析现象：随着盐浓度的继续升高，例如，达到饱 和和半饱和的程度，蛋白质的溶解度逐渐变小， 彼此之间相互凝聚而发生沉淀，此现象称作盐析 (satting-out) 。
特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。
应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯 化。
3. 凝胶过滤层析法
原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，
30000 的外源蛋白几乎不分泌 , 使下游纯 化复杂化
不适于高密度发酵,难于产业化生产
四、毕赤酵母 表达系统
高稳定。表达载体整合在染色体上，构建
的菌株十分稳定。
高表达。细胞生长速度快，醇氧化酶启动
子很强，导致外源蛋白产量很高。
高分泌。分泌信号（如α因子）已被应用
于该表达系统。
外源蛋白的分泌表达及翻译后修饰
第四章 蛋白质的修饰和表达
第一节 蛋白质修饰的化学途径
蛋白质修饰的化学途径
一、功能基团的特异性修饰 二、基于蛋白质片段的嵌合修饰
一、功能基团的特异性修饰
天然氨基酸侧链中，约有一半可以在足够 温和的条件下产生化学取代而不使肽键受 损，其中氨基、巯基和羧基特别容易产生 有用的取代。
任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可 能出现不止一次，如果用化学的方法对 氨基酸进行修饰时，正常情况下所有相 关的氨基酸侧链都要被取代。 尽管处在侧链上和末端的氨基和羧基基团 的pK值有差别，但在化学上很难将肽链 的-氨基或-羧基基团与侧链上的氨基或 羧基相区别。
更
适合用于医药蛋白
外源蛋白在毕赤酵母中获得分泌表达的最大好处 就是得到的蛋白质翻译后加工，包括二硫键的形 成、蛋白质折叠及糖基化等。与啤酒酵母等其他 一些真核表达系统相比，毕赤酵母对外源蛋白糖 基化更接近于哺乳动物的糖基化。
五、提高外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中表
达量的途径
优化基因内部结构 改造分泌信号

选择高表达的启动子
筛选高拷贝转化子
调整甲醇浓度和诱导时间 选择合适的培养温度
阻止外源蛋白降解
选择合适的酵母菌生长密度
六、其他表达系统
昆虫表达系统
卵母细胞表达系统
无细胞表达系统
第四节 重组蛋白的分离纯化
重组蛋白的分离纯化
1.超速离心法 2.选择性沉淀法 3.凝胶层析法 4.离子交换层析法 5.亲合层析法 6.反相色谱和疏水色谱
二、两个主要的哺乳动物细胞表达系 统
瞬时表达系统
稳定表达系统
瞬时表达系统是一个简单、有效的外源 蛋白表达手段，其表达水平最高可以达 到稳定细胞表达水平。蛋白质是由未整 合的、不复制的质粒DNA产生的，这样 使得蛋白质表达的时间相对短，只有48h 到7天。
稳定表达系统需要得到稳定转化的细胞株， 需要1～2个月的时间，在稳定转化的细 胞中，DNA被整合到染色体中，这使得 重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。
进行盒式突变的两个关键问题： 1. 在目标基因序列中，要有适当的限制性 内切酶识别位点，使得用以取代天然 DNA序列的盒式突变序列可以有效的 插入目标基因中。 2. 各种适合的，用以取代目标基因中特定 DNA片段的突变DNA的得到 。
二）基因融合
1. 基因融合技术表达外源基因的缘由和方式
2．蛋白质分子嵌合体设计
3．蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连
接
4.融合蛋白标签和报告分子 5.tRNA介导的蛋白质工程
利用基因融合技术表达外源基因
基因融合策略，主要是有利于外源基因 的表达、表达产物的分离、纯化以及细 胞定位。作为蛋白质分子改造可以借用 这些策略对蛋白质分子中的特定序列、 结构元件乃至结构域通过基因剪接来进 行操作。
经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种 分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分 子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝 胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时
间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝
2．二硫键与嵌合蛋白质的形成 3．嵌合蛋白质—通过化学激活形成肽键
4．融合蛋白质—通过酶连接反应形成肽键
5．通过非肽键形成嵌合蛋白质
第二节 蛋白质改造的分子生物学途径
一、概述
分子生物学改造蛋白质的主要途径是基因 突变。 基因突变:在基因水平上对其编码的蛋白 质分子进行改造，在其表达后用来研究 蛋白质结构功能的一种方法。可分为位 点特异性突变和随机突变。
四、大肠杆菌表达体系的应用
外源蛋白质的分子量小于70kD
不存在半胱氨酸或分子内的二硫键少于
3～4个，
不需要翻译后修饰而能保持其生物活性
的蛋白质
重组蛋白质 在哺乳动物细胞中的表达
哺乳动物细胞表达体系的优点 两个主要的哺乳动物细胞表达系统
一、哺乳动物细胞表达体系的优点
具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以 及二硫键在合成和分泌过程中自然而然 的正确形成 哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完 全生物活性的蛋白质。
功能基团特异性修饰的途径
1．多位点取代 2．单一的或限制性取代 3．次级取代
1．多位点取代 (1) 常规的氨基保护 (2) 亚氨代乙酰基
(3) 其他的侧链取代
2．限制性取代
(1)-异硫氰酸苯酯对-氨基的选择性 (2) 羰基二酰肼的亲核取代 (3) 蛋白醛 (4) 通过蛋白质水解的逆反应产生蛋白和 肽的-酰胺 (5) 蛋白醛—由糖的化学氧化产生
二、蛋白质改造的分子生物学途径
一）基因突变技术 二） 基因融合
一） 基因突变技术
1.编码基因的专一性位点突变 2．区域性定向突变
1.编码基因的专一性位点突变
专一性位点突变又称特异性位点突变。这 类突变都是在含有突变序列的寡核苷引 物介导下进行的，因此又称为寡核苷酸 介导的位点特异性突变。这种突变的方 法从问世至今不断更新，特别是PCR技 术出现后变得更高效。
PCR技术的出现为基因的突变，基因的 剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的 道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋 白质编码的基因序列上产生插入、缺失、 取代等突变。
基因突变分两类：
位点特异性突变和随机突变 位点特异性突变分三种类型：
通过核寡苷酸介导的基因突变 盒式突变或片段取代突变
利用聚合酶链反应（PCR），以双链DNA 为模板进行的基因突变
盒式突变法：利用目标基因中所具有的适 当的限制性内切酶位点，用具有任何长 度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片 段来置换或取代目标基因上的一段DNA 序列。又称片段取代法。
盒式突变最主要的用途是产生各种特异性的 突变或突变家族，在这些突变体中各种不同 的序列被集中在目标基因的一个特定区域， 从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构 域的结构和功能提供了一个切实可行的方法。
D. 引物与模板DNA的比率
E. 模板DNA的退火和引物延伸条件
F. DNA聚合酶的选择
(2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法
A. Kunkel 突变法 B. 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 C. 基于去除特定限制酶切位点的突变
D. 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 a.利用常规PCR方法在基因5`末端区域或3` 末端区域产生取代,插入,缺失的突变 b.利用重叠延伸PCR技术对基因中心区域 片段进行取代突变,插入突变,缺失突变
2．区域性定向突变
基因工程技术不但可使基因产生特异性位 点突变，也可以产生区域性的突变。
用途：产生各种特异性的突变或突变家族， 在这些突变体中各种不同的序列被集中在 目标基因的一个特定区域，从而为研究蛋 白质特定结构区段或特定结构域的结构和 功能提供了一个切实可行的方法。
常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)， 又称片段取代法(DNA fragment replacement)。
一、大肠杆菌表达体系
大肠杆菌(Escherichia coli)是研究得最为详尽的一 个模式生物。这种只有1.6微米长的、可以迅速繁 殖的单细胞原核生物，已经成为实验室和基因工 程的重要工具。
大肠杆菌(E.coli)表达体系是目前应用最广的一 个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选 体系。
二、大肠杆菌表达体系优点:
3．次级取代
(1)与蛋白醛偶联—亲核取代物
(2) 与蛋白质活性亲核物偶联—醛取
代物
二、基于蛋白质片段的嵌合修饰
通过非共价键相互作用、二硫键、常规肽
键(通过化学法或酶法产生)或其他非肽共
价键，可以将较小的肽段连在一起，这就
是通过半合成对蛋白质进行工程操作的原
则。
方法：
1．通过非共价缔合系统产生嵌合蛋白质
遗传学和生理学背景清楚
容易培养，特别是高密度发酵
外源基因经常可以达到高效表达。
三、大肠杆菌表达体系缺点:

不能进行典型真核细胞所具有的复杂 的翻译后修饰，如糖基化、烷基化、磷 酸化、特异性的蛋白水解加工等 二硫键的形成以及外源蛋白质组装成 多亚基复合体的能力也受到限制。

外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性 的包涵体；而当真核基因在大肠杆菌中表达时， 作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白 质的N末端。最后，由于真核mRNA的结构特 性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异， 当用真核mRNA的序列直接在大肠杆菌细胞中 表达时，有时不能得到足够的产物。