电泳检测提取质粒情况
• 每条桌子留一组同学配置1%琼脂糖凝胶， 同时负责点样和电泳，最后将电泳结果扫 描保存图片。 • 注意记住点样的顺序，并在图片上面做好 标记！
配置培养基
（用于农杆菌培养和转化） 用于农杆菌培养和转化） • 每两人准备40 ml LB培养基——用于农杆菌 感受态制备。灭菌后室温保存备用。 • 每两人准备2个LB固体培养基（每个平皿中 20 ml培养基,一个有卡那霉素,一个没有抗生 素）——用于农杆菌转化。每条桌子派一组 同学配制培养基。灭菌后4 ℃保存备用。 • 上述培养基由一组同学负责。同时这组同学 在2010年10月21日星期四pm12:00— pm2:00负责接种农杆菌，准备周五做感受以8000rpm离心10min，弃上清，敞开离心管口 并倒置离心管，使上清全部流尽。 （每个人35ml菌液） 1、将35ml 培养物的细菌沉淀物重悬于0.35ml溶液Ｉ中。 2、加0.7ml新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次， 以混合内容物。切勿剧烈振荡！然后将离心管放置在冰上5 分钟。 4、加0.5ml用冰预冷的溶液Ⅲ。封住瓶口，反复颠倒离心瓶数 次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。于冰上 放置10min，会出现一白色絮状沉淀。（沉淀应包括染色体 ＤＮＡ、 高分子量RNA和钾－SDS－蛋白质－膜复合物） 5、４℃条件下，12000rpm，离心15min。然后尽可能将上清 全部转到另一离心管中，弃去残留的粘稠状液体。
6、上清转移到2个1.5ml离心管中（每管约0.75ml），加等体积酚/氯仿 （0.75ml/管）抽提一次，室温下12000rpm离心5min，上清各转移到新 的1.5ml离心管中，加等体积的异丙醇（0.75/管），充分混匀，于-20℃ 放置30min。 7、4 ℃ 条件下，12000rpm离心15min，回收核酸。 8、小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，室温下用70％ 乙醇洗涤沉淀。倒出乙醇，并除去附于瓶壁的所有液滴，室温下将瓶倒 置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发完全。 9、用TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。每只EP管中加入约50µl。然后集中在一只 EP管中。 10、加入RNAase 3µl（10mg/ml）消化其中的RNA，37 ℃条件下反应1h。 取出后做好标记，交到老师处。 11、电泳检测质粒提取情况和RNA消化情况。
质粒的大量提取之细菌的培养及收集
1、将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期（OD600约0.6)。培养基中应 含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体培养物进行接种。 2、将含相应抗生素的500ml LB或Terrific肉汤培养基（预加温至37℃）加入25ml对 数晚期的培养物，于37℃剧烈振摇培养2.5h（摇床转速300转/分），所得培养 物的OD600值约为0.4。 3、可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇）， 使终浓度为170µg/ml。 有些质粒只要生长达到，新一代的质粒（如pUC质粒）可复制到很高的拷贝数， 因此无需扩增。但像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝复制质粒，有必要扩 增。用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积 和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细 菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。 4、于37℃剧烈振摇（300转/分），继续培养12-16小时。" 5、 于4℃以5000rpm离心5min，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管，使上清全 部流尽。
在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因， 可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含 有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒 的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的 一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的 两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型 。 质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA； 松弛开环的OC构型； 超螺旋的SC构型。 由于琼脂糖中加 有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带 成橘黄色。 道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝 胶的最后边； 道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒 之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间 。
实验一 低拷贝质粒的大量提取
质粒提取原理
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组 的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立 于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信 息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在 DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外 源基因构成重组体。 从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的 实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：培养细菌使质粒扩 增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。
质粒大量提取之碱裂解法
• 该法是Ｒ．Ｔreisman尚未发表的方法，同 时也是Brinboim和Ｄoly(1979)及IshHorowicz和Burke(1981)所用方法的改进。 该方法对于目前使用的所有大肠菌菌株都 卓有成效，并可与随后的纯化步骤，如聚 乙二醇沉淀或氯化铯－溴化乙锭梯度平衡 离心等，一并联合使用。
碱裂解法准备试剂
1、 溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 10mmol/L EDTA(pH8.0)溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下 蒸气灭菌15min，贮存于４℃。 2、 溶液Ⅱ: 0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1％ ＳＤＳ 盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室 温放置5-10分钟。防止NaOH接触空气中的CO2所以要现用现配。 3、 溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml。所配成的溶 液对钾是３mol/L，对乙酸根是5mol/L。) 4、 溶菌酶溶液: 10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)。当溶液的pH值 低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。