7．影响质粒DNA提纯质量和产率因素的说明。 (1)菌株 质粒的宿主菌菌株的不同对质粒DNA纯化的质量和产率很大。一般 最好选用enA基因 突变的宿主菌，即enA-菌株，如DH5α,JMl09和XL1—Blue等。使川含野 生型enA基因的菌株会影响质粒DNA的纯度。 enA基因是核酸内切酶I。核酸内切酶I是一种12kDa的壁膜蛋白，受 镁离子激活，可被EDTA抑制，对热敏感。双链DNA是核酸内切酶I的底 物，但RNA是该酶的竞争性抑制剂．能改变酶的特异性，使其由水解产 生7个碱基的寡聚核苷酸的双链DNA内切酶活性，变为平均每底物每次切 割一次的切口酶活性。核酸内切酶I的功能仍不清楚，enA基因突变的菌 株没有明显的表现改变，但质粒产量及稳定性明显提高。细菌不同生长 期核酸内切酶I的 表达水平不同。生长的指数期较稳定期核酸内切酶I水平高300倍。此 外，培养基中促进快 速生长的成分如高葡萄糖水及补充氨基酸都会使核酸内切酶I水平增 高。 此外，菌株的其他性质有时也应加以考虑。如XL1—Blue生长速度 较慢。,HBl01及其衍生菌株如TG1及JMl00序列，含大量的糖，这些糖如 果在质粒纯化过程中不除去，在菌体裂解后释放出来，可能抑制酶活 性。 (2)质粒的拷贝数 细菌中质粒的拷贝数是影响质粒产量的最主要的因素。质粒的拷贝 数主要由复制起点 (replication origin)如pMBl及pSC101及其附近的DNA序列决定。这些 被称作复制点的区域通过细菌的酶复合物控制质粒DNA的复制。当插进 一些特殊的载体时，能降低质粒的拷贝 数。此外，太大的DNA插入也能使质粒拷贝数下降。一些质粒，如pUC序 列，由于经过了突变和改造，在细菌细胞内的拷贝数很大．以pBR322质
实验一 质粒DNA的提取 一、原理
采用碱变性发抽提取质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的 变性预复性的差异而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下，染色 体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。质粒DNA的大部分氢键也断 裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以 pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到 原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状 结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物 等一起沉淀下来而被除去。 二、方法
盖，激烈振荡，并加入固体Tris摇匀调pH(一般100ml苯酚约加l克固体
Tris)分层后测上层水相pH至7.6一8.0。从分液漏斗中放出下层酚相于
棕色瓶中，并加一定体积0.1mol／L Tris-HCI(pH8．o)覆盖在酚相上，
置4℃冰箱贮存备用。酚是一种强腐蚀剂，能引起腐蚀性损伤，操作时
应戴上眼镜和手套。如果皮肤上溅上了酚，应用大量水冲洗或用肥皂水

冲洗。酚在空气极易氧化变红，要随时加盖，也可加入抗氧化剂o．
1％8一羟基喹啉及o．2％β—巯基乙醇。
5．无水乙醇
置-20℃冰箱中保存备用
6．70％乙醇
置-20℃冰箱中保存备用
7．核糖核酸酶(10mg／ml)
配制方法：称取l0mg核糖核酸酶A(RNaseA，美国SIGMA或中科院上海
生物化学研究所东风试剂厂)。于灭菌的微离心管内，加1 ml 100mmol
EDTA,0.1mol/L NaOH,0.5%SDS)
配制方法：
NaOH O.4 g
SDS 0.5 g
加80mlTE缓冲液溶解。加TE缓冲液定容至lOOml.
3．3.0mol／1醋酸钠溶液(pH5.2)
配制方法：醋酸钠 24.6g
用70ml重蒸水溶解，再用冰乙酸大约调pH至5.2,加重蒸水定容至
100ml。
1. 挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆 菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基 （5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。
2. 将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上 清液。反复数次，收集全部菌体。
3. 倾去上清，滤纸吸干。 4. 加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L
过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须进行洗涤或重沉淀。
乙醇沉淀DNA．一般采用低温条件，这是由于在低温条件下．分子
运动大大减少，DNA易于聚合而沉淀。为了使质粒DNA能充分沉淀，一般
保存时间总是过长的，同时也要视样品的体积而异，在微量离心管中的
样品要比40毫升离心管中DNA样品的量少，冷却就较迅速。大量提取DNA
时，目前习惯上常采用如下几种方法：
保存在家用冰箱结冰盒内 过夜
保存在-2℃亡冰箱内
过夜
保存在-70℃冰箱内
30mm～2h
放置干冰中（约-20℃）
30min
放置干冰加酒精中(约-70℃) 16mm
放置在液氮缸中液氮的气相内，不可以浸在液氮中(温度在-198℃ 左右)5～15min。
除了用乙醇外还可用1倍体积丙醇(相当于2倍体积乙醇)使DNA沉 淀。用异丙醇的好处是要求离心的液体体积小，但异丙醇挥发性不如乙 醇，最终除区其残留部分的难度更大。 此外，异丙醇能促使蔗糖、氯化钠等溶质与DNA一起沉淀，在-70℃时， 更易发生，所以一 般以乙醇沉淀为宜，除非要求液体体积很小。
EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。 5. 加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L
EDTA,0.1mol/L NaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。 6. 加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，
纯净的酚使用时不需要重蒸。市售的酚一般为红色或黄色结晶体，使用
之前必须重蒸，除去能引起DNA和RNA断裂和聚合的杂质。将苯酚置于
65℃水浴中溶解，重新进行蒸馏，当温度升至183℃时，开始收集在若
干个棕色瓶中。纯酚和重蒸酚都应贮存在-20℃使用前取一瓶重蒸酚于
分液漏斗中，加入等体积的lmol／L Tris-HCI(pH8.0)缓冲液，立即加
／pH5.0的NaAC溶液(完全溶解)，即为10mg／ml RNase，为了破坏脱氧
核糖核酸酶(DNase，置80℃水浴中10min或100℃水浴2 min，然后置一
20℃(或家用冰箱的冰格内)保存。
四、材料
1．菌种： 大肠杆菌(pUC57) 2．培养基 LB液体培养基 精解蛋白胨 3g 酵母浸出粉 1.5g 氯化钠 3 g 葡萄糖 0.6g
2．在基因操作实验中．保存或提取DNA过程中，一般都采用TE缓冲 液，而不选用其它 的缓冲液。虽然很多缓冲系统．如磷酸盐缓冲系统，硼酸系统都符合细 胞内环境的生理范围，可以作为DNA的保存液，但在某些实验中，这些 缓冲对会影响实验。如在转化实验中，要用到Ca+，如果川磷酸盐缓冲
液，磷酸根将与Ca2+产生Ca(PO4+沉淀；在各种工具酶反应时，不同的 酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离子浓度，有的则 要求低盐浓度，采用Tris—HCI缓冲系统，不存在金属离子的干扰作 用；作中的EDTA是二价离子 Mg2+、Ca2+等的螯合剂，可降低系统中的这些离子浓度，而这些离产是 脱氧核糖核酸酶的辅 助因子，所以EDTA可以抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用。
三、试剂 1．TE缓冲液(10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0) 配制方法：
Tris
1.211g
EDTA.Na 0.037g
用800ml重蒸水溶解，用分析纯盐酸调整pH至8.0，加重蒸水定容至
1000ml。
2．TENS溶液：(10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L
沉淀细胞碎片及染色体DNA。 7. 上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，
12000r/min,离心2分钟。 8. 上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，
14000r/min，离心20分钟。 9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。 10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。 lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。 12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核 酸酶与管底液体混匀。 13．37℃水浴30min。 14．样品放一20℃冰箱保存备用。
化和带水的办法是将酚重蒸，除去氧化的部分，再用Tris—HCl缓冲液
饱和，使酚不至于夺去DNA中的水，带走部分DNA。饱和酚中加上8一羟
基硅啉及巯基乙醇，防止酚氧化，还是弱的螫合剂．可抑制DNase。由
于有颜色．溶解在酚中后，使酚带上
颜色，便于酚相与水相的分肉，酚饱和后，表面盖上一层Tris水溶液，
合沉淀，一般实验中，用2倍体积
的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的最终含量占67％左右。由此可预
见，也可用95％乙醇
沉淀DNA，但是用95％乙醇使总体积增大．而DNA在醇溶液中总有一定程
度的溶解。因而
DNA损失也增大，影响收率。
乙醇沉淀DNA溶液时，DNA溶液中应该有一定的盐浓度，中和DNA表
面电荷。如果溶液中盐浓度太低，要加NaAC或NaCl至最终浓度O.1一
1．质粒DNA提取的方法很多，有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、 溴化乙锭一氯化铯 梯度超离心法等。本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法也 有多种，但基本原理 和步骤是一致的．包括下述步骤：(1)裂解菌体细胞；(2)质粒和染色体 DNA的分离；(3)除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成 分；(4)除去提玑过程中使用的去垢剂、盐 等。
O.25mol／l在pH 8左右的DNA溶液中，DNA分子带负电荷，加一定浓度的
NaAC或NaCl使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电