②能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous replicon）。
③质粒对宿主生存并不是必需的。
Replication of plasmid
• stringent manner – 复制子（pSC101）的调节分子是RepA 蛋白，它对复制的起始具有正向作用，而对其自身基因的 转录具有负调控作用。严紧型质粒的复制需要蛋白质的不 断合成，这种质粒在每个细胞中只有1-5个拷贝。
溴化乙锭(ethidium bromide EtBr)：0.5ug/ml
荧光染料，含有一个可以嵌入DNA堆积碱基 之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几 乎没有碱基序列特异性。
SYBR gold fluorescence dye：
是一种特有的能够激发荧光的非对称花青 染料。
• 其灵敏度更高 • 当被波长为300nm的透射光照射时，可
Relaxed manner – pMB1/colE1复制子
质粒的应用
• 质粒的特点使质粒成 为携带外源基因进入 细菌中扩增或表达的 重要媒介物，这种基 因运载工具在基因工 程中具有极广泛的应 用价值。
• 大多数基因工程使用 松弛型质粒。
常用质粒
pGEM®-7Zf(-) Vector circle map and sequence reference points
超螺旋DNA＞线状DNA ＞开环DNA
2.凝胶浓度
3.电场强度
低电压时，迁移率与电压成正比。
当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范 围反而减小。要获得大于2kb DNA片段的 良好分辨率，电压一般不超过 5V/cm。
4. 缓冲液离子强度
TAE 比 TBE TPE 快10% 三种的分辨率相近
凝胶上DNA的染色
重组质粒的构建包括质粒酶切、酶切产物目的片段的回收、回 收片段与载体连接等步骤，涉及一系列相互关联的酶促反应。
3. 电泳
背景知识
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过α（1-3）β（1-4）交替构 成的线状聚合物。
Chemical Structure of Agarose
水平板凝胶电泳 垂直板凝胶电泳
• relaxed manner –在携带pMB1/colE1复制子的质粒中，正 向调节分子是一种RNA （RNAII），用作引发DNA前导链 的起始合成。其复制不需要任何质粒编码的蛋白质。完全 依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质。每个细胞中有 15-20个拷贝。
• 通过对复制子改造，拷贝数能达到500-700 （例如 pPUC19）。
binding site of pUC/M13 Reverse Sequencing Primer 158–174
2. DNA重组
背景知识
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的 DNA叫做重组体或重组子。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 +、ATP存在 的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子 进行连接。
质粒是一种小的双链环状DNA分子，是独 立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助 性遗传单位。
用于基因克隆的载体
必须具备的条件：
1）能够在寄主细胞内独立自主复制； 2）具有可检测的选择性标记； 3）具有多克隆位点； 4）具有较高的外源DNA的载装能力; 5) 具有针对受体细胞的可转移性。
载体种类：有来自大肠杆菌的质粒、λ噬菌体、 M13噬 菌体、噬菌粒外，还有酵母、细菌人工染色 体载体以及动、植物病毒载体。
121–140
lacZ start codon
162
lac operator
182–198
β-lactamase (Ampr) coding region
1319–2179
phage f1 region
2363–2818
binding site of pUC/M13 Forward Sequencing Primer 2939–2955
背景知识
1. 质粒与载体
1952， J. Lederberg reviews the literature on cell heredity and suggests the term plasmid for all extrachromosomal hereditary determinants.
Pouring a Horizontal Agarose Gel
影响DNA在凝胶中迁移率的因素
样品的物理性状 凝胶浓度 电场强度 缓冲液离子强度
1.样品的物理性状
DNA分子的大小
迁移率与碱基对数的常用对数成反 比。分子越大，迁移得越慢。
DNA构象
超螺旋环状 线状DNA 切口环状
质粒分子，在一定条件下，泳动率的大 小顺序为：
T7 RNA polymerase transcription initiation site
1
SP6 RNA polymerase transcription initiation site
123
T7 RNA polymerase promoter (–17 to +3)
2982–3
SP6 RNA polymerase promoter (–17 to +3)
以发出量黄色荧光
• 1：10,000稀释使用，用电泳缓冲液当天 配置，室温存放。
模块一 重组质粒构建和重组子Байду номын сангаас筛选与鉴定
实验一 质粒DNA的提取和电泳检测 实验二 重组质粒的构建：酶切、目的片段回收、连接 实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化 实验四 重组质粒的鉴定
分子生物学与基因工程实验技术
前言
模块一 重组质粒构建和重组子的筛选与鉴定 模块二 植物遗传转化 模块三 转化烟草的鉴定
模块一 重组质粒构建和重组子的筛选与鉴定
实验一 质粒DNA的提取和电泳检测 实验二 重组质粒的构建：酶切、目的片段回收、连接 实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化 实验四 重组质粒的鉴定
Characteristics of plasmids
①是染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋结构， 不同质粒大小在2-300 kb之间，＜15kb的小质粒比较容易 分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。