黑曲霉产糖化酶液态发酵条件研究孙继祥【摘要】The effects of additives,feeding time and feeding quantity on Saccharifying enzyme production by Aspergillus niger fermentation were investigated throug single factor test with the activity of Saccharifying enzyme as indicator.Then the effects of fermentation conditions on Saccharifying enzyme production were investigated by orthogonal experiments.The results suggested that the addition of（NH4） 2SO4 could enhance 17 % enzyme activity,the optimum feeding time was 48h,the best feeding quantity was 6 mL,feeding could prolong fermenting cycle from previous 96 h to 120 h,and the optimum fermentation conditions were 15 % inoculating quantity,50 mL liquid-filling in 250 mL triangle flask,and initial pH value as 4.5.%以糖化酶活力为指标,通过单因素实验,分别考察了添加物、补料时间和补料量对黑曲霉发酵产糖化酶的影响。

通过正交实验,考察了发酵条件对黑曲霉发酵产酶的影响。

结果表明,添加0.4%的（NH4）2SO4作为促进剂可使酶活提高17%,最佳补料时间为48 h,补料量6 mL,补料可使发酵周期由原来的96 h延长到120 h;最佳发酵条件为接种量15%,250 mL三角瓶装液量50 mL,初始pH为4.5。

【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2011(000)010【总页数】6页(P42-47)【关键词】黑曲霉;糖化酶;发酵条件;酶活力【作者】孙继祥【作者单位】河南皇沟酒业有限责任公司,河南永城476600【正文语种】中文【中图分类】Q93-3;TS261.1黑曲霉（Aspergillus niger）是一种常见真菌，属于半知菌类曲霉属[1]，它在各种基质中普遍存在，现已成为工业应用常见的菌种之一[2]。

黑曲霉产生的糖化酶对淀粉的水解能力很强，尤其是对谷物原料更是如此。

其在酒精工业[5]、淀粉糖工业，啤酒酿造、白酒和曲酒的生产，味精、柠檬酸[8]等生产工业过程中皆有重要运用。

糖化酶在我国酶制剂行业中占有非常重要的地位，其产量占全国酶制剂总产量的60%以上，产销量逐年增长[9]。

近几年，随着生物技术发展、石油资源紧缺，发酵行业发展特别快，糖化酶作为葡萄糖生产的主要酶种，其发展前景特别好。

虽然我国糖化酶发酵技术发展很快，但在技术水平和生产上仍存在诸如重复建设、工艺设备落后、研究开发不足、污染大[11]等问题。

这些问题已影响到我国酶制品的出口。

因此，大幅度提高糖化酶活力，提高酶收得率，降低生产成本已迫在眉睫。

本文结合公司的实际生产情况，对黑曲霉产糖化酶的液态发酵条件作了初步研究，主要包括发酵周期的确定，不同添加物、补料量、补料时间对黑曲霉发酵产酶的影响。

1.1.1 试剂蔗糖；可溶性淀粉；NaNO3；KCl；K2HPO4；MgSO4·7H2O；FeSO4；琼脂；玉米淀粉；玉米浆；尿素；DNS；黄豆粉；(NH4)2SO4；酒石酸；葡萄糖；NaOH；柠檬酸；HCl；硫酸铜。

1.1.2 仪器SWO-CJ-1F型超净工作台；立式圆形压力蒸汽灭菌锅，(YXQ.SG41.280)；冰箱；精密电子天平；721可见分光光度计；生化培养箱；电热恒温水浴锅。

1.1.3 菌种黑曲霉，培菌实验室保存。

1.1.4 培养基筛选培养基(g/L)（查氏培养基）：NaNO32 g，KCl0.5 g，FeSO40.01 g，K2HPO41 g，蔗糖 30 g，琼脂 16 g。

基础发酵培养基(g/L)：玉米淀粉10 g，玉米浆2 g，黄豆粉2 g，用柠檬酸调pH 值4.5。

补料培养基(g/L)：玉米淀粉10 g，玉米浆2 g，黄豆粉2 g，用柠檬酸调pH值4.5。

1.2.1 pH值的测定用精密pH试纸和酸度计测定。

1.2.2 糖化酶活力测定参照二硝基水杨酸法[14]。

一个酶活单位定义为在50℃、pH4.35条件下，每1 h 生成1 mg葡萄糖所需的酶量。

1.2.2.1 测定原理用一定量的糖化酶作用于淀粉，将淀粉水解成葡萄糖，葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸共热后可生成棕色氨基化合物。

在一定范围内，该棕色化合物颜色深浅与葡萄糖的量呈正比关系。

用分光光度计进行比色测定该物质在540 nm处的吸光度，计算出生成的葡萄糖含量，然后用生成的葡萄糖含量来计算糖化酶的活力。

1.2.2.2 试剂配制显示剂 (DNS)：取6.3 g DNS和262 mL 2 mol/L NaOH加入到500 mL内溶182 g酒石酸钾钠的热水中，再加入5 g重蒸酚和5 g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后，加水定容至1000 mL，贮藏于棕色瓶中，7 d后使用。

葡萄糖标准溶液(1 mg/mL)：准确称取干燥恒重的葡糖糖1 g，加入少量溶解后，再加入8 mL 12 mol/L的浓盐酸,以蒸馏水定容至1000 mL。

0.1 mol/L乙酸缓冲溶液（pH4.5）：取13.6 g三乙酸钠溶于300 mL的蒸馏水中，定容至1000 mL，用冰乙酸调pH至4.5。

2%可溶性淀粉：取2.0 g可溶性淀粉加热溶于100 mL乙酸溶液中。

1.2.2.3 酶液制备取0.5 mL发酵液置入200 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释定容，即得到稀释的粗酶液。

1.2.2.4 测定方法在5 mL的2%可溶性淀粉溶液中加入5 mL适量稀释的酶液，50℃下保温反应10 min，用滴管吸取1～2滴反应液滴入比色板中，用碘液检查，以保证有淀粉残余，然后立即在沸水浴中煮沸10 min停止反应。

取反应液1 mL，加入1 mL DNS，沸水浴加热5 min，取出再加入蒸馏水8 mL，摇匀，分光光度计540 nm处测定吸光度值。

每个样做3个平行实验。

1.2.2.5 标准曲线的绘制分别吸取 1 mL、2 mL、4 mL、6 mL 和 8 mL 的葡萄糖标准溶液于5支试管中，再分别加入9 mL、8 mL、6 mL、4 mL、2 mL蒸馏水。

另取6支试管，前5支分别加入上述不同梯度葡萄糖溶液1 mL，第6支管加入1 mL蒸馏水。

然后再加入DNS试剂1 mL，沸水浴中加热5 min，立即用水冷却，最后加入蒸馏水8 mL，摇匀，分光光度计540 nm处测定吸光度值。

以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线，见图1。

由图1可得回归方程y=1.3577x+0.0003，则其斜率为1.3577，即K0=1.3577。

1.2.2.6 计算方法式中：X——酶活力单位，U/mL；N——稀释倍数；10——所得反应液为所用反应液的10倍；60/10——定义时间与实际反应时间之比；K——实际所测样品的吸光度；K0——标准曲线的斜率，为1.3577，表示1 mL反应液中含有1 mg葡萄糖时的吸光度。

1.2.3 总糖测定参照DNS比色法[16]。

1.3.1 黑曲霉的分离纯化按配比称取查氏培养基原料，加蒸馏水混合均匀，加热并不断搅拌，待原料全部溶解后稍微冷却，用蒸馏水定容至500 mL。

121℃下灭菌20 min，待冷却至50℃左右，倒入已经灭过菌的培养皿中，每个平板约倒0.5 cm厚度的培养基。

取0.1 mL保藏菌种依次稀释到10-10，取其中10-7～10-10涂平板，用移液枪吸取稀释液移入平板中，涂布均匀，倒扣，放入恒温箱中32℃培养。

48 h后，选取含菌落20～50个的平板挑取单菌落，在斜面培养基中划线，在32℃下培养48 h，获得试管种子。

1.3.2 菌种的保藏将获得的斜面种子用牛皮纸包扎，做好标记，存放于4℃冰箱中。

1.3.3 发酵周期的确定用基础发酵培养基对菌种的发酵周期做了考察，250 mL三角瓶装液量为50 mL，接种量为10%，32℃、200 r/min摇床培养，每24 h测1次酶活，以酶活最高为准，确定发酵周期。

孢子悬浮液的制备：以l0 mL无菌水注入斜面试管，轻微振荡后倒入灭过菌的烧杯，用无菌水稀释到50 mL，得到根霉菌株孢子悬浮液。

1.3.4 添加物对产酶的影响按配比称取玉米淀粉、黄豆粉，加水混合，加热并不断搅拌至淀粉糊化，稍微冷却后，加入淀粉酶液化，再加玉米浆，用柠檬酸调pH值至4.5。

按每瓶50 mL分装到250 mL三角瓶中，分别加入 NaNO3、(NH4)2SO4、尿素。

每个样中加入量分别为0.2%、0.4%、0.6%，于121℃灭菌20 min，冷却后用事先灭菌的移液管吸取孢子悬浮液5 mL，接入三角瓶中，然后将三角瓶放入旋转摇床上32℃、200 r/min培养96 h。

1.3.5 培养条件的优化采用Lg(33)正交表设计，发酵接种量为10%、15%、20%，发酵装液量为30 mL、50 mL、70 mL，初始pH值为3.5、4.0、4.5。

发酵 96 h，测定酶活力。

1.3.6 补料量对产酶的影响使用250 mL三角瓶，装样50 mL，接种20%，在旋转摇床上200 r/min于32℃培养120 h，在48 h时，补料1次，补料培养基同发酵培养基。

补料量分别为0、4 mL、6 mL、8 mL 和 10 mL，分别在 72 h、96 h和 120 h测糖化酶活力的变化趋势。

1.3.7 补料时间对产酶的影响使用250 mL三角瓶，装样50 mL，接种20%，在旋转摇床上200 r/min于32℃培养120 h。

考察不补料，时间为32 h、48 h补料的发酵差异，同时分别测定还原糖、糖化酶的酶活变化。

本实验中主要对发酵液中糖化酶的活力、pH及总糖的变化做了检测，结果见图2～图4。

从图2可看出，酶活在48 h之前增长缓慢，48 h后迅速增长，96 h后达到最高，到120 h时，酶活下降。

可能的原因是，接种24 h后，孢子开始萌发，菌丝开始生长，之后由于条件适宜，菌丝开始大量生长，菌体进入指数生长期，此时菌体活力旺盛，菌体生长速率和基质消耗速率成正比，这个时期菌体主要以生长繁殖为主，产酶速率不是很高。