课题3 血红蛋白的提取和分离
【学习目标】1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白
2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理
【学习重点】凝胶色谱法的原理和方法
【学习难点】样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填
1．基础知识
蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。
1．1凝胶色谱法（分配色谱法）：
（1）原理：（图5－13a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
（3）分离过程：（图5－13b）
混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子
【补充】洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
1．2缓冲溶液
（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，
NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。
1．3凝胶电泳法：
（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
［思考］阅读教材后，填写下表：
（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。
（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
2．实验设计
2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？
样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。
【思考】：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？
不是。
因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。
2.2选择实验材料
（1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？
哺乳动物血液。
因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。
（2）请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。
并思考回答下列问题：
血液由血浆和各种血细胞两部分组成。
血细胞中红细胞细胞数量最多，细胞的含量中，除水以外，最高的化合物是血红蛋白。
该化合物是由两条α-肽链和两条β-肽链构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的亚铁血红素基团。
2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。
洗涤红细胞的目的是什么？
除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。
红细胞的洗涤过程为
血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水→缓慢搅拌
10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色
【思考】：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？
防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。
【思考】：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？
加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。
【补充】：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。
加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。
2.4如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？
透析。
半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。
思考：为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？
维持血红蛋白的正常特性。
有利于杂质分子充分地向外扩散。
2.5凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。
（1）根据教材图5－19，说出制作色谱柱需要的材料。
（2）色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱
（3）凝胶色谱柱的装填。
请阅读教材：
色谱柱的装填过程。
（4
调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质3.操作提示
（1）红细胞的洗涤：
洗涤次数不能过少；低速、短时离心。
（2）凝胶的预处理：
沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡
（3）色谱柱的装填：
装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。
（4）色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。
【实例探究】
例1 利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（）
A. 相对分子质量大的
B. 溶解度高的
C. 相对分子量小的
D. 所代电荷多的
例2 蛋白质提取和分离分为哪几步（）
A. 样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
B. 样品处理、凝胶色谱操作、纯化
C. 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定
D. 样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定
例3用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（）
A路程较长，移动速度较慢B路程较长，移动速度较快
C路程较短，移动速度较慢D路程较短，移动速度较快
【巩固练习】
1. 凝胶色谱法分离蛋白质的依据是（）
A. 对其他分子的亲和力
B. 溶解度
C. 所带电荷多少
D. 相对分子质量的大小
2. 选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料，有何好处（）
A. 血红蛋白是有色蛋白
B. 红细胞无细胞核
C. 红细胞蛋白质含量高
D. 红细胞DNA含量高
3. 将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（）
A. 甲苯
B. 血红蛋白水溶液
C. 脂溶性物质的沉淀层
D. 其他杂质的沉淀
4. 下列操作正确的是（）
A. 分离红细胞时采用低速长时间离心
B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可
C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心
D. 透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h
5. 下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（）
A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液
B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取
C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化
D. 可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度
6. 凝胶色谱法操作正确的是（）
A. 将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴
B. 将橡皮塞下部切出凹穴
C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面
D. 将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片
7.早在上世纪六十年代，在美国的黄石国家森林公园发现了一种嗜热细菌，从这种细菌中分离提取了一种酶，称为TaqDNA聚合酶。
实验得知PCR反应变性时温度为950C，经50个循环后TaqDNA聚合酶仍有65%的活性。
（1）若要培养嗜热细菌，培养基中应有水、碳源、、等营养物质。
在此基础上，培养该菌时需先将培养基____ 。
（2）若将培养细菌的培养基用于植物组织培养，还应加入________ 。
（3）TaqDNA聚合酶可用于PCR，原因是该酶有，因此在PCR扩增时可以加入。
（4）请将下列实验流程图补充完整：
（5）凝胶色谱法和凝胶电泳法是分离蛋白质的两种常用方法，据此回答问题。
①凝胶色谱法分离蛋白质的原理是根据不同大小的蛋白质分子在凝胶柱中的不同而实现分离的：
②使用电泳法分离蛋白质．是利用了待分离样品中各种分子的差异，以及分子本身的、形状的不同。
答案（1）氮源无机盐 pH调至中性或微碱性
（2）植物激素
（3）热稳定性一次性
（4）血红蛋白的释放凝胶色谱柱的填充
（5）①移动速率②带电性质大小。