混合营养物制品。
组成和作用
---营养物质：蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、 鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐类
---水 ---凝固剂：琼脂、明胶 ---抑制剂 ---指示剂
4
培养基的种类（按用途分类）
基础培养基：培养营养要求不高的细菌，如普通平板。 营养培养基：能满足营养需求较高细菌的生长，如血平板。 鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克
液体培养基接种法 半固体穿刺接种法 :用于观察细菌动力 斜面接种法 倾注培养法:用于细菌计数 涂布法
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
其他接种方法
5
细菌培养法
一般培养（需氧培养）
---培养温度：35℃（采用恒温培养箱） ---培养时间：18～24h
二氧化碳培养法：二氧化碳培养箱、烛缸法、化学法 厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养
2017-10-11
细菌内毒素的检测
目的： 主要用于诊断病人是否发生革兰阴性细菌感染。 用于检测注射用液和生物制品有无内毒素污染。
检测方法： 家兔发热法 鲎试验
细菌外毒素的测定
体内毒力试验：细菌外毒素对机体的毒性作用，可被
相应抗毒素中和，若先给动物注射抗毒素，然后再注射外 毒素，则动物不产生中毒症状。
有动力 现象
无动力 现象
细菌的生物化学鉴定技术
3
6
细菌的代谢产物检测与鉴定
碳水化合物的代谢试验 蛋白质和氨基酸的代谢试验 碳源和氮源利用试验 酶类试验 抑菌试验
碳水化合物的代谢试验
糖类发酵试验 氧化－发酵试验 β－半乳糖苷酶试验（ONPG） 七叶苷水解试验 甲基红试验 VP试验
细菌非培养检验技术
10
7
PCT 的临床价值
早期诊断在感染发生2-3h血浆PCT 浓度就会升高 病情监测：在脓毒血症和休克时PCT 含量最高, 随着感染的恢复PCT 也随着下降 预后判断：动物实验证明，PCT 是一个潜在的致 死因子，本身不会启动脓毒性反应但可放大并加 重脓毒性的病理反应，当PCT 含量升高时死亡率 也升高。
染色方法：
结晶紫 1分钟 卢戈碘液 1分钟 95％乙醇 30S～1min 稀释复红
初染
媒染
脱色
复染
影响革兰染色的关键步骤是脱色
革兰染色意义
★有助于鉴别细菌 ★有助于选择用药 ★有助于了解细菌的致病性
革兰染色结果
紫色－－革兰阳性菌 红色－－革兰阴性菌
革兰阳性菌
革兰阴性菌
抗酸染色法(acid fast stain)
细菌检验自动化设备
分析前自动化 微生物标本前处理系统
分析中自动化 自动染色系统 自动血液培养系统 自动化细菌鉴定药敏系统
分析后自动化 微生物医院内感染分析系统
细菌检验的自动化
3
临床微生物鉴定方法学的演化
Pow e r
oI n si i ng
Va c u um
Ne g a ti v e
质谱分析
分子测序
细菌接种的基本程序
灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本 沾取标本 接种 灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境
细菌接种法
平板划线分离接种法： 目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个
菌落，以便获得纯菌。
---分区划线法：适用于含菌量较多的标本 ---连续划线法：适用于含菌量较少的标本
染液组成：石碳酸复红、3%盐酸酒精、美蓝 染色结果：抗酸菌呈红色，非抗酸菌和细胞呈蓝色 应用
多用于抗酸菌的染色， 如结核分枝杆菌的染色等。
3
负染色法
用细菌不能结合的材料进行 染色,如酸性染料、墨汁 在黑背景下可看到透光的细 菌,主要用于真菌的检查
其他特殊染色法
异染颗粒染色法 荚膜染色法 芽孢染色法
细菌检验基本技术
《临床微生物学和微生物学检验》 主编 刘云德 楼永良 第二章 P5-P26
温州医科大学检验医学 生命科学学院 温州医科大学附属第一医院 周铁丽
•1
本节目的要求
掌握 标本的采集和处理原则 细菌的形态学检查 细菌的分离培养和鉴定 细菌的非培养检测方法
了解 细菌检验的自动化
•2
感染性疾病诊断的实验室手段
细菌的培养和分离技术
3
无菌技术
是指在执行细菌学检验的过程中，防止一 切非目的微生物侵入培养基和保持无菌物品及 无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。
接种工具
接种环接种针 接种罩 无菌工作台 无菌室 生物安全柜
培养基（culture medium）
定义：是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的
形态学检查 病原菌分离培养和药敏试验 非培养的感染指标的检测 分子生物学检测 ……
细菌检验标本采集的基本原则
病程早期采集标本 抗菌药物使用前采集标本 无菌操作 安全采集 根据目的菌的特性用不同的方法采集 选择合适的采集时机和标本种类 采集适当标本量
细菌检验标本运送的基本原则
标本采集后立即送至实验室
采集后最好在2h之内送到实验 不能及时送检者多数应4℃冷藏，一般不超过6h 脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌应保温送检，床旁接种
体外毒力试验：免疫学测定
---双向琼脂扩散 ---琼脂扩散
动物实验
常用动物：小鼠、豚鼠、家兔 接种途径：皮内、皮下、腹腔、静脉、脑 主要用途：分离和鉴定病原微生物
测定细菌的毒力 制备免疫血清 建立致病动物模型 动物的血液用于配制细菌培养基 用于生物制品或一些药物的评价
血清学鉴定
试剂（诊断血清）：含抗体 检测对象：特异性抗原 方法：直接凝集试验（玻片法）、荚膜肿胀试验
自动化鉴定系统
商品化手工鉴定条 快速测试(血清 , 免疫） 传统的生化反应测试管 形态学
9
重点掌握
细菌检验标本运送和处理的基本原则 革兰染色的染液组成、原理、方法、结果、意义
抗酸染色的染液组成和结果判断 培养基的定义、成份和分类 细菌分离培养的目的 细菌生长情况描述 主要生化反应的原理和应用（特异性） 非感染标志物的应用
核酸杂交 核酸扩增技术
主要应用
菌种鉴定 细菌耐药基因检测 菌株同源性分析
基因芯片（microarray chip）
细菌分子生物学检测技术的评价
优点： 检测简便，时间短，灵敏度高，早期诊断
结果解释：
微生物培养阳性清楚地的表示活的微生物的存在 ◦ 特异微生物的抗体的滴度上升表示感染后的反应
耐药基因检测和耐药的关系 ……
氏双糖培养基（KIA）。
选择培养基：具有选择性抑制作用，用于选择性的培养目
的菌，如SS平板。
特殊培养基：用于特殊培养要求的细菌,如厌氧培养基。
培养基的种类（按物理性状分类）
液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。 半固体培养基：含0.3％～0.5％琼脂，用于观察细菌的动力。 固体培养基：含2％～2.5％琼脂，多用于细菌的分离培养。
降钙素元是正常人血清中存在的含116个氨基的糖蛋 白，最初由甲状腺C细胞产生，血清水平很低。 在非感染或病毒性感染疾病时保持非常低的血清水平 ，在细菌性感染时含量升高，并与感染程度和预后呈 正相关。 PCT含量的变化稳定，并出现在疾病的早期（3-4h） ，半衰期短（24h）。 国外把PCT作为最敏感的感染标志。 正常血清水平100-150 pg/ml。
容器须经灭菌处理，不得使用消毒剂 注意安全防护，防止标本外溢和流出
烈性传染病标本必须按规定包装，由专人运送
厌氧性标本应隔绝氧气
专门的运送瓶、试管、注射器运送
细菌形态学检查
3
1
细菌形态学检查的意义
迅速了解临床标本中有无细菌及大致的数量， 根据其形态、结构和染色性大致决定其种属。 可为细菌进一步鉴定提供依据 验证培养物是否纯种 界定标本中的细菌为感染/污染、定植 有少数细菌可根据形态学的检查得出初步诊断 血培养的快速报告
3
常用的非培养感染标志物
广泛的感染标志物
白细胞计数与分类 血沉 C-反应蛋白（CRP） 白介素-6 ……
相对特异的感染标志物
临床常见细菌感染的标志物 真菌感染的标志物 ……
40
Wenen LIU
临床常见细菌感染标志物
降钙素原检测
毒素检测
Wenen LIU
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降钙素元（Procalcitomin PCT）
菌落的特征和类型
★菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明
度、湿润度、黏度、溶血性
★菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M）
细菌在液体培养基中的生长现象
混浊 沉淀 菌膜
细菌在半固体培养基中的生长现象
有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿
刺线边缘模糊。
无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。
碱性染料：电离后带正电荷，一般情况下细菌都带负电荷，
故细菌着色。最常用。 如结晶紫、美蓝和碱性复红等常用于细菌染色
复合染料: 姬姆萨染料
2
常用细菌染色方法
革兰染色法（Gram stain） 抗酸染色法（acid-fast stain） 荧光染色
革兰染色法（Gram染色）
染液组成：
结晶紫染液、卢戈碘液、95％乙醇、稀释石碳酸复红
法、硫乙醇酸盐法等
细菌在固体培养基中生长情况
纯培养－－挑取一个菌落，移种到另一培养基中，生长出来的
细菌均为纯种，称为纯培养（pure culture）。
菌落－－经过一定的时间（约18～24小时）培养后，单个细菌
分裂繁殖成一堆肉眼可见的细菌集团，称为菌落（colony）。
菌苔－－菌落生长过分密集而形成片状，称为菌苔（mossy）。
形态学检查（II）---染色标本检查法