2.3 胞内活性氧水平的检测与分析
DCFH-DA单染法
DCFH-DA
DCFH ROS
DCFH-DA进入细胞在细胞内酯酶作 用下脱去二脂形成不发荧光的DCFH， 当细胞内存在H2O2，O2-，OH-等 ROS时被氧化成发绿色荧光的DCF。
DCF
注意事项：
结果分析
——数据分析中几种常见图形及分析原则 （1）阴性细胞群（峰）和阳性细胞群（峰）分群明显
分析原则： 根据阴性对照界定阴性置信区； 允许阴性对照非特异性荧光信号（假阳性率）一般小于 1%~5%； 可记录阳性细胞百分率或平均荧光强度。
（2）样本管与阴性对照管峰形重叠
样本管峰形左侧右移，右侧有肩峰，弱阳性的 样本常出现此类图形。
分析原则： 根据阴性对照界定阴性置信区，阴性置信区应 设在两曲线分离处；
微珠10μL（用前震荡混匀） Buffer：190μL
2. 四种常见流式细胞术
2.1 细胞凋亡的检测与分析
2.1.1 PI单染法 2.1.2 Annexin-Ⅴ-PI双染法 2.1.3 线粒体膜电位法
凋亡启动
凋亡早期
凋亡晚期
2.1.1 PI单染法
基本原理： • 正常细胞DNA含量：2n~4n • 凋亡细胞：核内DNA断裂，乙
流式细胞术常见实验分析
流式细胞术常见实验分析
1. Guava easycyte 8HT 操作流程
2. 四种常见流式细胞术
细胞凋亡的检测与分析 DNA含量检测与细胞周期分析 胞内活性氧水平的检测与分析 细胞表面分子的检测与分析 组合实验
1. Guava easycyte 8HT 操作流程 ——Incyte模块
1.1 开机-清洗
（原则：先开仪器后开软件，开机必清洗）
1.2 采集样本 1.3 分析 1.4 关机
（原则：先关软件后关仪器，关机前必清洗）
1.5 日常维护
1.1 清洗
edit WL
1.2 样本采集
• 1.3 分析
见具体实验的分析。
• 1.4 关机
1.5 日常维护
保持空气干燥，会使激光器的使用寿命长一些。 桌面不要有震动，以免光路发生偏移。 上机前检查废液瓶是否已满，若已满或将满请倒掉，用超纯水冲洗两
醇固定后膜通透性增加，小片 段DNA穿膜丢失，胞内DNA含 量减少。PI染色后，荧光强度 减小而形成一个DNA含量小于 2n的分布区（亚G1峰）。
操作方法与结果分析见细胞周期部分。
优缺点：
• 优点：简便，快捷，价廉，应用普遍。
• 缺点：
2.1.2 Annexin-Ⅴ-PI双染法
基本原理：
磷脂酰丝氨酸（PS）能与连接素 Ⅴ（AnnexinⅤ）发生特异结合； PI是核酸荧光染料，不能透过正 常细胞膜，只能进入已经破损的 细胞膜。
2.2.3 M期特异性检测
G2期是指DNA合成后期，M期是细胞分 裂期。二者在细胞周期事件中所处的时项 不同，所表示的生物学意义也大不相同。 准确检测M期的变化对细胞增殖、凋亡及 癌症的研究相当重要。M期的检测标志是 丝氨酸磷酸化组蛋白H3(pH3)。当细胞周 期从G2期转换到M期时，染色质上的组蛋 白H3Ser10发生磷酸化，并在有丝分裂后 快速的去磷酸化。由此组蛋白H3的丝氨 酸磷酸化变化将停留在G2期的细胞与M期 的分裂细胞区分开来。
遍，放回原位；洗涤液瓶若已空或将空请补满（ICF：ddH2O=1：4）。 实验台面保持整洁，废物缸请及时倒掉。自己的东西实验后请收走，
流式专用的物品请不要带走。 做完请记得登记。 每周在周一进行一次easycheck。
（自己在做实验之前也可进行easycheck，流程见下面。）
easycheck
2.2 DNA含量检测与周期分析
2.2.1 DNA倍体分析——PI染色法 2.2.2 S期特异性检测 2.2.3 M期特异性检测
2.2.1 DNA倍体分析——PI染色法
基本原理：
细胞周期与DNA含量变化极其FCM分析直方图
H
A
W
结果分析
——Guava原软件分析
Red-A
Red-A
Red-W
Red-W
正常细胞 凋亡细胞
488nm
+
-
+
-++
+
-+
590nm
488nm +
-+
529nm
结果分析
用488nm激发，黄光和绿光通道收集荧光信号，调补偿纠正绿色荧光（单体） 和黄色荧光（聚合物）的重叠部分。线粒体膜电位采用比例法，即根据绿色 荧光与黄色荧光阳性百分率之比。
Ratio=G.M./Y.M.
比值升高，膜电位降低，膜受损。
在用第三方软件分析之前，请将流式结果按如下所示导出。
结果分析
——Modfit软件分析
结果分析
——Modfit软件分析
图片拷贝：直接Ctrl+C
结果分析
——Flowjo软件分析
2.2.2 S期特异性检测
S期DNA合成期，S期的比例增多往往与细胞 分裂的活跃程度相关。传统的PI染色可以通过 DNA的倍增区分G1期与G2/M期。S期则因界 限不明显，难以区分。若需要准确的统计S期 的变化，需要加入S期的特异性标志，即BrdU。 BrdU只在DNA合成时被掺入核酸，是指示 DNA复制的金标准。因此可通过BrdU-Alex Fluor® 488与PI复染将S期准确的区分开来。
PI
Annexin Ⅴ-FITC
PI/Annexin Ⅴ-FITC
荧光交叠
荧光补偿原理
荧光补偿
AnnexinⅤ -FITC单染
优缺点：
2.1.3 线粒体膜电位法
基本原理：
线粒体膜电位下降是细 胞凋亡早期的一个标志 性事件。
JC-1：亲脂性阳离子荧 光染料，特异性地与线 粒体内膜结合，膜电位 高时呈聚合体，膜电位 低时呈单体。
可记录阳性细胞百分率（近似值）或平均荧光 强度或弱阳性；
允许阴性对照非特异性荧光信号（假阳性率） 高些，但阳性细胞百分率（近似值）应减去假 阳性率。
样本管峰形整体右移。在排除非特异性染色的情况下（如设置严格 的对照、调节抗体浓度等），方能进行分析。
正常细胞：膜完整，PS不外翻——PI-/AnnexinⅤ凋亡早期：膜完整，PS翻转——PI-/AnnexinⅤ+ 凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加——PI+/AnnexinⅤ+ 坏死细胞：膜严重破损，PS不外翻——PI+/AnnexinⅤ+
几乎不存在膜结构——PI+/AnnexinⅤ-
结果分析
阴性对照