原染色，细胞内标记需要固定、破膜等步骤 1.细胞表面抗原的标记法（外周血为例 ） 全血50ul（5×105）+10ul相应抗体→避光孵 育15-30min → 溶血素→ 室温10min → PBS洗1次 →上机分析（1% 多聚甲醛固定）。
2. 细胞浆或核内抗原标记法 收集单细胞悬(1×106)+固定剂A 去固定液 破膜剂B及抗体
任意门、矩形门
线性门
四象门
多重逻辑门：当一种细胞有两种以上的参数需要被 分析时，常需要设多个门，各门之间由此出现逻 辑关系，此种设门技术称为多重逻辑门或联合门。
淋巴细胞
T淋巴细胞（CD3+）
CD3+CD8（CD4+）
IFN-r
IL-4

数据显示采用的图:散点图、直方图、密度图 和二维等高图等。最常用的为单参数直方图 和双参数散点图。
室温，15 min 室温，15 min
洗涤
PBS洗涤1次
上机分析（1% 多聚甲醛固定）。 3. 细胞表面和细胞内抗原同时标记 在流式分析中通常需要细胞膜表面和细胞 内同时标记，首先标记表面抗原，然后再对细胞 膜和核膜进行固定破膜后再标记胞内或核内抗原。 常见细胞破膜剂：
0.05%皂角素、0.1%曲拉通 (Triton X-100)、70%乙醇、 商品化固定破膜剂（A、B）。
100目钢筛网过滤 1000r/min，5min PBS 洗2次
300目尼龙网 单细胞悬
5. 脱落细胞单细胞悬液的制备
包括：
尿液脱落细胞
胸水、腹水脱落细胞 冲洗液脱落细胞
收集胸水、腹水、尿液、冲洗液 沉淀 取底部10-20ml 300目尼龙滤网过滤 收集方法、沉淀时间
臵 4℃ 冰箱中 PBS洗 3 次
四色分析：三色分析+ECD DNA含量分析： PI 凋亡与坏死分析： 凋亡用Annexin V-FITC/PI双染
四、标本的收集、单细胞悬液的制备
骨髓、外周血、细胞株、组织器官、 胸水、腹水、尿液脱落细胞等
1、骨髓及外周血细胞单细胞悬液的制备
骨髓及外周血都是天然的单个细胞，可直接标记， 再溶血。 单细胞的分离制备 分离液 离心 血液+生理盐水
体时，将DNA含量直
方图分为三部分，
G0/G1 (2C)
S (2C→4C)
即G0/G1、S、G2/M
三个细胞峰。
G2/M G2/M
(4C) (4C)

方法：
细胞悬液（1*106） 70%冰乙醇
4º ，24h C
离心去固定液
30min
PBS洗2次
PI
避光,30min
RNase
上机
PBS洗1次
采集10000细胞，MultiCycle软件进行细胞
流式细胞术实验方法及应用
何玉萍
科研型
分选功能 488nm激光
Our weapon：EPICS ALTRA Flow Cytosorter
四色荧光
(525、575、610
、675nm）
一、流式细胞术的原理
流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的 研究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒， 经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细 胞依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧 光素细胞受激发产生不同的荧光信号，这些荧 光信号可以反映细胞的生物特性。
周期分析
G0/G1 (2C)
S (2C→4C) G2/M (4C)
当人体癌变或者具有恶性潜能的癌前病变时， 在其发生、发展过程中可伴随有细胞DNA倍体及S期 的改变（异倍体） 恶性肿瘤细胞增殖周期的判断： S>10、G2/M>15或S>20、G2/M>5
2、 淋巴细胞亚群分析
白细胞分化抗原（CD分子）的命名：
藻红蛋白（PE）
碘化丙啶（PI） 藻红蛋白偶联物（PECY5） 藻红蛋白偶联物（PECY7） 别藻青蛋白（APC）
488
488 488 488 633
575（橙）
610（红） 667（红） 767（红外） 660（红）
别藻青蛋白偶联物 （APC-CY7）
633
767（ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ外）
2. 要有高的光子产量---提高信号强度。
PBS洗一次
抗体:
上机分析
CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三标抗体


CD19-PE/CD3-FITC二标抗体 CD16+56-PE/CD3-FITC二标抗体
激光
前向散射
FALS Sensor
Freq
Fluorescence
侧向散射，荧光信号
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
近30年来流式细胞术在我国得到很 快的发展，应用范围不断增大。目前， 流式细胞术作为一门生物检测技术广泛 应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞 遗传学、细胞生物学、生物化学等临床 医学和基础医学研究领域。
生理盐水
1000r/min，5min
300目尼龙网过滤
离心
研磨法
组织块洗去血液 单细胞悬液。 研磨器研至匀浆 离心 100目钢筛网 PBS洗2次 300目尼龙网过滤
1000r/min，5min
4. 石蜡包埋组织单细胞悬液的制备
手术获得的新鲜实体组织，常要送病理石蜡包 埋处理，这些标本也可用于流式细胞术的检测。
CD3+
CD3+CD8+ CD3+CD4+
NK+/CD3-
CD（16+56）+/CD3+ （T-cell）
NK细胞: CD(16+56)+/CD3-
CD19+/CD3-
CD19+/CD3+ （T-cell）
B淋巴细胞: CD19+/CD3-
外周血淋巴细胞亚群标记方法（表面标记）
50ul+10ul相应抗体 避光孵育15min 室温10min 加OptiLyes C溶血素250ul
FSC
SSC
九、流式细胞术的应用及标记方法
1、DNA含量分析 意义：肿瘤的早期诊断，肿瘤的良恶性判断，观察细胞的 增殖状态及细胞周期分布。 正常生物细胞，DNA含量随着细胞增殖周期时相而发 生变化。即G0/G1期（2C）、S期（2C→4C） G2/M期 （4C）。
2C→4C
2C
4C
FCM进行细胞周期DNA含量分析时，需要对 DNA进行染色，DNA染料（PI）与DNA结合具有特 异性，有一定量效关系，即DNA含量的多少与荧 光染料的结合量成正比，荧光强度与DNA吸收荧 光分子多少成正比。FCM分析一个 细胞群周期与DNA倍
流式细胞结合单克隆抗体技术能准确分类 计数淋巴细胞亚群，被认为是血液中淋巴细胞 免疫表型分析的标准方法。血液淋巴细胞是一 群特异性极强的细胞，根据淋巴细胞的功能及 膜表面标志，主要分为T淋巴细胞(CD3+)、B淋 巴细胞(CD19+)、NK细胞(CD16+56+/CD3-)三个 亚群。
T淋巴细胞（CD3+） 淋巴细胞 B淋巴细胞（CD19+） NK细胞（CD16+56）+
剪成小块 PBS 洗2次
剪至浆状
制备仪
2-3min
300目尼龙网过滤
离心
剪碎法
1000r/min，5min
单细胞悬液。
吸管轻轻吹打
组织块洗去血液
100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。
网搓法
组织块洗去血液 收集滤液 PBS 洗2次 100目钢筛网轻搓 单细胞悬液。
醇乙脱水： 70％→80%→90％→ 95% →100%醇乙→二甲苯→石 蜡包埋 脱蜡水化： 二甲苯脱蜡→ 100％醇乙 →90%→80%→70％→50％ →蒸馏水
石蜡包埋组织制备 单细胞悬液
石蜡包埋组织切片
乙醇，蒸馏水
二甲苯脱蜡 胰蛋白酶
1-2天
水化
组织器官
37℃，15-30min
冰PBS 过滤 离心 液
1982年世界卫生组织和国际免疫学会联合会， 将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划 分为25群，把每一群抗体称为一个分化抗体群 (Cluster of Differentiation，CD)，进行编号、 命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由CD抗体 群识别的分化抗原就称为CD分子。目前已有339个 分化抗体群被鉴定并命名
六、荧光染色对照设臵(空白对照
同型对照 )
、阳性对照、阴性对照、
1、空白对照
用缓冲液（PBS）代替单克隆抗体进行实验
2、阳性染色对照 用现有试剂和方法检测已知表达某种特 异性抗原的细胞即为阳性细胞。如检测血小板CD62P时， 可用被ADP诱导活化血小板作为CD62P检测的阳性对照细 胞。
3.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴 性细胞群，如CD3/CD19双染检测健康人血液淋巴 细胞亚群时，应有一群不表达这两种抗原的双阴 性细胞群（主要是NK细胞），可作阴性对照。 4. 同型对照 与染色的单克隆抗体特异性无关的免 疫球蛋白亚型，如IgG-FITC、IgG-PE
2500r/min，20-30min
单个核细胞
单核细胞: 利用单核细胞在短时培养贴壁快 的特性（30-40min），可采用短时培 养获得较纯的单核细胞.
2、培养细胞样品的制备(贴壁细胞)
培养板
胰蛋白酶
吸去培养液
37℃，室温，3-5min
PBS洗2次
含血清的培养基
吹打
PBS洗2次
单细胞悬液。
3. 组织器官单细胞悬液的制备
抗与待测标本反应后，洗去未结合抗体再加