病人的呕吐物，沾染粪便的衣服和用具，也
可作为检材。
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（2）送检 剧烈腹泻病人的水样便含有大 量病菌，直接分离培养不难检出阳性。不
能立即检查的，要接种于培养基内，尽快 送往检验室。送检标本可放入（PH8.6-9.0） 碱性蛋白胨水，也可放入文—腊二氏保存 液或插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基 中。
菌体尾端有鞭毛，运动极为活泼，在暗视野 显微镜下呈流星样运动，培养温度以37℃为 最适宜，在碱性（PH8.8～9.0）肉汤或蛋白 胨培养基上易于生长。
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霍乱弧菌染色图片
革
鞭兰毛染 Nhomakorabea染
色
色
A
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分群和分型：
根据O抗原的特异性，可将霍乱弧菌分成139个 血清群。
根据是否与O1抗血清凝集分两大群， O1群霍乱弧菌：凡能与O1群抗血清发生凝集 非O1群霍乱弧菌：凡不被O1群抗血清凝集的。
的编码。 ▪ O139菌可以产生荚膜 ▪ 与O1群霍乱无交叉免疫力 ▪ 环境适应能力强 ▪ 耐药性强
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标本采集和送检
1、粪便采集
（1）采样 应在发病早期，服用抗菌药物之 前完成，并尽快送到检验室。粪便标本采 集方法如下：用棉拭子采取自然排出的新 鲜大便，也可用直肠棉拭或采便管由肛门 插入直肠内3cm-5cm处采取，水样便采取 1ml-3ml，成型便采取指甲大小的粪便量。
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鉴定
TCBS上出现黄色菌落，4号琼脂或庆大霉素 平板上出现灰褐色中心的菌落，均为可疑 菌落，应使用O1群和O139群霍乱弧菌的多 价和单价抗血清进行玻片凝集试验，结合 菌落特征和菌体形态，作出初步报告。
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疑似菌落鉴定基本要求：
分别从庆大霉素琼脂或TCBS 琼脂、碱性琼脂
平板上各挑取5 个以上的（少于5 个的全部挑取） 疑似菌落接种于营养琼脂斜面置37℃18-24h 纯培养（即每份样品至少从4 个分离平板上获 得约20 株可疑菌落菌株），取斜面纯培养物 进行O1 群及O139 群霍乱诊断血清玻片凝集试 验，血清凝集阳性的菌株继续相关的系统鉴定 并报告结果。必须注意同一样品中O1、O139群 霍乱弧菌可能同时存在，有必要对所有选出的
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A
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TCBS 平板培养菌落形态（呈黄色）
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快速诊断
标本
增菌培养 碱性蛋白胨水
分离培养（TCBS、碱性平板）
血清学鉴定
初步报告
检验程序
生化鉴定分型
确诊报告
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直接涂片 动力、制动试验
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谢谢大家！
A
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样品分别接种一个9cm 直径的庆大霉素琼脂或 TCBS 琼脂平板和一个碱性琼脂平板进行划线 分离培养。
同时，以无菌吸管吸取0.2-0.5ml 增菌液接种 到新的碱性蛋白胨水中，进行二次增菌培养后， 再如上述步骤进行划线分离培养。
特别强调所有环境样品的增菌分离培养步骤必 须包括上述二次增菌和强、弱双平板分离。
+
Ⅳ组噬菌体裂解
+
Ⅴ组噬菌体裂解
-
El-Tor 生物型 D + + + +
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O1群霍乱弧菌的血清分型
型别
别名
O抗原成份
原型
稻叶型（Inaba）
A、C
异型 中间型
小川型（Ogawa）
彦岛型 （Hikojima）
A、B A、B、C
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非O1群霍乱弧菌
O139群霍乱弧菌 1992年，在印度印度马德拉斯、泰米尔纳
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培 养1
先以碱性蛋白胨水（pH 8.6）作为增菌液； 再用强选择性分离培养基使用庆大霉素培
养基或TCBS 培养基或4号培养基； 弱选择性培养基使用碱性琼脂或碱性胆盐。 应注意不同厂商以及不同批号培养基的质
量，每批培养基在使用前必须进行质量检 测。
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培养 2
检样经碱性胨水37℃，8-12h 增菌后，每份
菌株都进行凝集试验，以免遗漏。
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生化鉴定
用于霍乱弧菌的鉴定试验有：①霍乱红试验:霍乱弧菌 的两种生物型均呈阳性反应，但是，本反应并非霍乱弧 菌特有，许多能分解色氨酸和还原硝酸盐的细菌，均能 产生阳性反应；②糖发酵试验:霍乱弧菌分解葡萄糖、 蔗糖、甘露醇产酸不产气，不发酵阿拉伯糖；③粘丝试 验:弧菌属细菌除副溶血弧菌部分菌株外，均有此反应； ④O/129敏感试验：参照药敏试验方法进行。将O/129 10μg和150μg的纸片贴在接种有待测菌的琼脂平板上， 35℃孵育18～24h后，纸片周围出现任何大小的抑菌环 均为敏感；O1群和非O1群霍乱弧菌均敏感，但已有对 O/129耐药的菌株出现；O139群对O/129耐药，用此试验 作鉴定时需特别谨慎，需结合其他试验结果加以综合考 虑；⑤耐盐试验:霍乱弧菌可在不含氯化钠和含有6％氯 化钠培养基中生长，氯化钠浓度高于6％则不生长。
霍乱弧菌的采样与检测
宁波市疾控中心 微生物检验科 杨元斌
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概况
霍乱弧菌（V.cholera）是人类霍乱的病原 体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传 染病之一。曾在世界上引起多次（7次）大 流行。
主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水，死 亡率甚高。属于国际检疫的烈性传染病。
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病原学
霍乱弧菌属于弧菌科弧菌属，革兰染色阴性 菌体短小，稍弯曲，两端钝圆，长1.5～ 2.0µm,宽0.3～0.4µm 。
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2、环境水体：
水体的采样一般要求用灭菌的500ml 水样 瓶采集相对静止的30cm 以内）500ml，加 盖密封后在室温表层水。取水点的选择应 结合流行病学调查等资料确定，同时，采 样时应选择在水流平稳或静止处吸取。非 疫情状态下的监测采样时间一般在清晨时， 此时水体未受人群活动等因素影响。每个 采样点中采样位置应相距数米、采集不少 于2 瓶做为平行检测。 （20-25℃）下送 实验室检测。
德发生的霍乱疫情，分离到的菌株不与O1 群霍乱血清凝集，但是引起O1群霍乱的典 型症状。引起WHO重视，定为O139群霍乱弧 菌，被认为下一次霍乱大流行主角。
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O139的生物学特征：
▪ 生化特征与O1菌基本相同。 ▪ 含有与O1群霍乱弧菌相同毒力基因 ▪ 除O抗原不同外，其它性状均与EL-Tor生物型相似。 ▪ 毒力蛋白及其调控因子与El-Tor霍乱具有高度同源
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O1群霍乱弧菌的生物型
1、古典生物型（前六次大流行）
2、E1 Tor 生物型（第7次 1961年来）。
两个生物型具有相同的血清型。我国流行以 El Tor霍乱弧菌为主。
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霍乱弧菌古典生物型和 El-Tor生物型的区别
特征
古典生物型
羊红细胞溶血
-
鸡红细胞凝集
-
VP 试验
-
CAMP 试验
-
多粘菌素 B 敏感试验
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3、水产品
水生动物的采样通常选取活的或新鲜的水生动 物为采集对象，
有时也应考虑冰冻的水生动物，以无菌操作采 集合适的部位，如鳃部和/或肠内
容物等，置采样瓶（管）或食品采样袋密封， 在常温下送检。有条件的采样点可
将水生动物整体采回实验室再进行相关处置。 同时，要求以无菌棉签涂抹五只（条）以上的 某类水生动物体表、鳃及/或肛门，置碱性蛋 白胨水送检，每管碱性蛋白胨水作一份样品看 待。