50% PEG 1min内加完;
2min内加10ml培养液
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细胞融合
SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2～5
1ml 50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置
90秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG
作用
根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每
单克隆抗体与基因工程抗体的制备
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第一节 杂交瘤技术的基本原理 一、杂交瘤技术 二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存
第二节 单克隆抗体的制备 一、单克隆抗体的产生 二、单克隆抗体的纯化 三、单克隆抗体的性质鉴定 四、单克隆抗体的特性
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第三节 基因工程抗体制备 一、人源化抗体 二、小分子抗体 三、抗体融合蛋白 四、双特异性抗体 五、噬菌体抗体库技术
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4
抗体种类：
第一代抗体 多克隆抗体（polyclonal antibody) 第二代抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody) 第三代抗体 基因工程抗体（genetic engineering antibody)
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B淋巴细胞:寿命短,分泌 特异系性抗体 骨髓瘤细胞：寿命长 杂交瘤细胞：寿命长， 单克隆抗体
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细胞冷冻的意义
防止污染 避免染色体丢失 防止非分泌细胞的过度生长 防止细胞密度过高而死亡
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第二节 单克隆抗体的制备
经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细 胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞 外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而 使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还 应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制 备单克隆抗体。
免疫脾细胞的制备： 1×108的淋巴细胞 无菌手术
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饲养细胞： 细胞密度过低不利于细胞生长繁殖 常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞 其中MQ还有清除死亡细胞的作用 饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞 的纯化
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饲养细胞
。
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融合方法
骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3)
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一、杂交瘤技术
流 程
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（一）小鼠骨髓瘤细胞
不产生Ig的重链和轻链 HGPRT-;TK与提供淋巴细胞的动物品系相同
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（二）免疫脾细胞
动 物：
BALB/c小鼠 7～12周龄 20g～25g体重
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免疫小鼠
细胞性抗原： （1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次
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细胞融合剂：
PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞 膜易打开而有助于细胞融合 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的 PEG，其纯度与毒性有所不同
PP择对数生长期的细胞进行传代培养 细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐 避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞 注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存 于-80℃或液氮及干冰中
可溶性抗原： 首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周 100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫
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淋巴细胞
。
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淋巴细胞发育
。
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浆细胞
。
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抗原接种
。
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（三）细胞融合
培养液： RPM1640培养液 DMEM培养液
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有限稀释法
特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法
方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.5～1个细胞
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效率最高 价格昂贵
FACS
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杂交瘤细胞的冻存与复苏
配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml) + 细胞冻存液 (30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培养液， 10%DMSO ) “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮 “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、 复苏
第四节 单克隆抗体的应用 一、检验医学诊断试剂 二、蛋白质的提纯 三、小分子抗体的应用 四、抗体融合蛋白的应用 五、双特异抗体的应用 六、抗体库技术的应用和前景
思考题 小结
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第一节 杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术原理：
聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾 细 胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆 化增殖的杂交瘤 细胞系 单克隆抗体生成：接种杂交瘤 细胞于小鼠腹腔，腹水 中即可得到高效价的单克隆抗体
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骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交瘤细胞
SP2/O: HGPRT- ，TK-; 长命 脾细胞: HGPRT+ ，TK+ ;短命(7天) 杂交瘤细胞:HGPRT+ ，TK+; 长命
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杂交瘤细胞：
长期生长繁殖 利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤 碱并最终与T一起合成DNA 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力
孔细胞数为（0.5～1.5）×105个。融合后7天，换用HT培
养液
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融合细胞的早期培养
10～20天出现克隆 HAT筛选 挑克隆
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（四）杂交瘤细胞的选择性培养
HGPRT酶与TK酶： 次黄嘌呤磷酸核糖转化酶 胸腺嘧啶核苷激酶
应用液： 8-杂氮鸟嘌呤 聚乙二醇
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HAT培养基：
H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物， 阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前 体”，供细胞通过替代途径合成DNA
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HAT选择作用：
淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成 的主要途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡； HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻
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二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存
有限稀释法(limiting dilution) 显微操作法(micromanipulation) FACS法（fluorescence activated cell sorter） 软琼脂平板法(soft agar method)
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